ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 3, с. 286-292
УДК 577.113.6
КОМПОЗИТЫ ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С НАНОЧАСТИЦАМИ ДИОКСИДА ТИТАНА. Ш+. КИНЕТИКА ДИССОЦИАЦИИ ПНК ИЗ НАНОКОМПОЗИТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ДНК/ПНК-ДУПЛЕКСЫ
© 2014 г. Р. Н. Амирханов*, **, В. Ф. Зарытова*, Н. В. Амирханов*, #
*ФГБУНИнститут химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН,
630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8 **Новосибирский государственный университет Поступила в редакцию 16.10.2013 г.
Принята к печати 09.12.2013 г.
При доставке пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК) в клетки в составе нанокомпозитов TiO2 • PL • ДНК/ПНК, состоящих из наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином (PL), и ДНК/ПНК-дуплексов, важным является не только их транспорт в клетку, но и возможность управления скоростью высвобождения препарата из нанокомпозита за счет диссоциации иммобилизованного ДНК/ПНК-дуплекса, после чего ПНК уходит в раствор. Выявлено, что константа скорости диссоциации ДНК/ПНК-дуплекса в составе 1Ю2 • PL • ДНК/ПНК-нанокомпозитов зависит от числа комплементарных пар оснований в иммобилизованном ДНК/ПНК-дуплексе. Времена полуудерживания ПНК в составе исследованных нанокомпозитов с числом перекрывания в дуплексе, равным 10, 12, 14 и 16 п.о., составляют соответственно 10, 14, 22 и 70 мин. Таким образом, показано, что скорость высвобождения ПНК-препарата из созданных нанокомпозитов можно регулировать, меняя число перекрывания комплементарных пар оснований в иммобилизованном ДНК/ПНК-дуплексе. Создаваемые ТЮ2 • PL • ДНК/ПНК-нанокомпозиты в перспективе могут быть использованы с целью эффективной доставки терапевтически значимых ПНК для их селективного воздействия на патогенные нуклеиновые кислоты в клетке.
Ключевые слова: пептидо-нуклеиновые кислоты, ДНК/ПНК-дуплексы, регулируемая диссоциация, кинетика, доставка лекарственных ПНК-препаратов в клетку, полилизин, нанокомпозиты, диоксид титана, наночастицы.
DOI: 10.7868/S0132342314030038
ВВЕДЕНИЕ
При создании эффективных лекарственных препаратов важным является не только их транспорт и доставка к мишени, но и возможность освобождения препарата от носителя-транспортера после доставки его в клетку [2—7]. В последнее время для доставки ген-направленных лекарственных препаратов в качестве носителей достаточно широкое применение находят наноматери-алы [8—11]. Иммобилизация препарата при этом должна быть обратимой [5], поскольку препараты,
+Сообщение II см. [1]. Сокращения: PBS — калий-фосфатный буфер, содержащий 0.01 М KH2PO4, 0.14 М NaCl, рН 7.5; PL - полилизин; TBS -Трис-НС1-буфер, содержащий 0.01 М Трис-HCl, 0.14 М NaCl, рН 7.5; siRNA (small interfering RNA) — малые интерферирующие РНК; НК — нуклеиновые кислоты; ПНК — пептидо-нук-леиновая кислота; р1иПНК — флуоресцеин-меченная ПНК. #Автор для связи (тел.: +7 (383) 363-51-23; факс: +7 (383) 363-51-53; эл. почта: nariman@niboch.nsc.ru).
прочно связанные с носителем, в большинстве случаев мало доступны для взаимодействия со своей НК-мишенью внутри клетки. Это обусловлено стерическими трудностями, создаваемыми самим носителем.
В последнее время для доставки НК в клетки был предложен ряд подходов к их обратимой иммобилизации на носитель-транспортер. Так, например, описанная обратимая иммобилизация нуклеотидного материала на наноразмерные полиэлектролитные комплексы основана на электростатическом взаимодействии отрицательно заряженных фосфатных групп НК с положительно заряженными остатками аминогрупп на носителе [3—5]. Описан метод обратимой фиксации 81ЯМЛ с помощью дисульфидных 8-8-мостиков в виде их 81ЯМЛ-фосфолипидных коньгатов на различного рода полимерных мицеллах [4]. Также было предложено использовать селективное высво-
Таблица 1. Структура модельных ДНК/ПНК-дуплексов и их характеристики [1]
Олиго-мер Структура P дуплексов Дуплекс Длина перекрывания, п.о. T °C в растворе T °C на твердой фазе
ПНК1 ДНК1 NC AAC TCCA TATGCCAT 3TTTTTCTAGTTGAGGTAT5' Pi 10 51.0 63.0
ПНК1 ДНК2 NC AAC TCCA TA TG CCAT 3TTTTTCTAGTTGAGGTATAC5' P2 12 60.5 71.0
ПНК1 ДНКз NC AAC TCCA TA TG C CAT 3TTTTTCTAGTTGAGGTATACGG5' P3 14 72.2 74.0
ПНК1 ДНК4 NCAAC TCC ATA TG CC AT 3'CTAGTTGAGGTATACGGTACAT5' P4 16 73.8 80.0
Курсивом латинскими буквами обозначены структура ПНК, N и С-концы ПНК-цепей соответствуют 5'- и З'-концам ДНК [12].
бождение олигонуклеотидов, иммобилизованных на золотых наностержнях, путем импульсного облучения таких нанокомпозитов лазерным светом [2]. Однако, хотя фиксация НК на носителях всеми этими способами обратима, скорость высвобождения нуклеотидов является фиксированной и не поддается регуляции.
Контроль скорости высвобождения препарата необходим для доставки терапевтического препарата к мишени в составе композита и последующего эффективного его воздействия на мишень. Преждевременная диссоциация препарата может отрицательно сказаться на общей эффективности доставки нуклеотидного материала в клетки, а чрезмерная стабильность его фиксации на носителе — на эффективности его воздействия на внутриклеточную мишень [4]. Для обеспечения необходимого баланса между двумя состояниями препарата требуется определенная (оптимальная) прочность фиксации препарата на носителе.
Ранее с целью создания препаратов с обратимой иммобилизацией терапевтически значимых пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК) [12—14] на носителе нами были предложены нанокомпозиты 1Ю2 • PL• ДНК/ПНК [1], полученные путем неко-валентной иммобилизации гибридных ДНК/ПНК-дуплексов на 1Ю2 наночастицы, покрытые полилизином (РЦ) [15]. Было показано, что созданные на-нокомпозиты способны эффективно доставлять ПНК в живые клетки [15]. Обратимость фиксации ПНК в этом случае обеспечивается за счет диссоциации иммобилизованного ДНК/ПНК-дуплекса, а прочность фиксации ПНК регулируется за счет изменения термостабильности такого дуплекса, то есть простым изменением числа комплементра-ных пар оснований в нем [1]. Однако для конструирования композитов с оптимальной скоростью высвобождения препарата недостаточно знать лишь термодинамические характеристики удер-
живания ПНК-препарата на носителе. Необходимо знание конкретных кинетических параметров удерживания или высвобождения ПНК-пре-парата из нанокомпозита.
Целью настоящей работы является исследование кинетики десорбции ПНК из состава TiO2 • PL • ДНК/ПНК-нанокомпозитов и оценка величин наблюдаемых констант скоростей диссоциации и времени полуудерживания ПНК в составе нанокомпозитов в зависимости от числа комплементарных пар оснований в иммобилизованном ДНК/ПНК-дуплексе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования кинетики диссоциации ДНК/ПНК-дуплексов, иммобилизованных на TiO2-частицах, покрытых полилизином, были использованы модельные нанокомпозиты TiO2,PL,P1, TiO2 • PL • P2, TiO2 • PL • P3 и TiO2 • PL • P4 (табл. 1), содержащие гибридные ДНК/ПНК-дуплексы P1, P2, P3 и P4 с различной длиной участка перекрывания комплементарных пар оснований, полученные, как описано в работе [1]. Из табл. 1 видно, что с увеличением в дуплексе числа перекрывающихся комплементарных оснований температуры плавления дуплексов (Tm) как в растворе, так и на твердой фазе закономерно увеличиваются.
Для исследования кинетики десорбции ПНК из TiO2 • PL • ДНК/ПНК-нанокомпозита использовали меченную флуоресцеином (Flu) ПНК (Р|"ПНК) [15], которую сначала использовали для формирования ДНК/ШиПНК-дуплекса, а затем созданный дуплекс иммобилизовали при пониженной температуре на наночастицах TiO2 • PL с образованием TiO2 • PL • ДНК/FluПНК-нанокомпозита. Для того чтобы одновременно следить за поведением ДНК в составе нанокомпозита, в 5'-конец ДНК-фрагмента вводили остаток радиоактивно-
и и
К
(D tf
О
<D р
О
^
О
л н о о
к «
и
о X
(D Н
К
И
70
50 -
30
Флуоресценция (р1иПНК) ]
А-Г
Радиоактивность ([32P] ДНК)
20
40 60
t, мин
Рис. 1. Кривая зависимости интенсивности флуоресценции (1) и радиоактивности (2) от времени при выдерживании нанокомпозита TiO2 • PL • [5,-32Р]ДНК1/Г1иПНК1 при постоянной температуре (35° С) в PBS. Кривая 1 — десорбция флуоресцентно меченной Р1иПНК1? кривая 2 — десорбция радиоактивно меченной [5'-32Р]ДНК1.
го 32Р (см. методы). При этом обеспечивалась возможность параллельной регистрации флуоресцентной и радиоактивной метки в компонентах ТЮ2 • РЬ • [5'-32Р]ДНК/ИиПНК-нанокомпозита.
Аликвоты полученных нанокомпозитов выдерживали при фиксированной температуре в течение различного времени. Количество десорби-рованной с носителя ИиПНК или [5'-32Р]ДНК оценивали после центрифугирования суспензии нанокомпозита, измеряя интенсивность соответственно флуоресценции или радиоактивности в супернатанте. Степень десорбции ПНК определяли как отношение количества ИиПНК в супер-натанте к общему количеству ИиПНК, использованной изначально для иммобилизации. Степень десорбции ДНК определяли, измеряя количество радиоактивности, обнаруженной в супернатанте, и суммарную радиоактивность супернатанта и осадка. По полученным данным строили кривые зависимости десорбции ИиПНК и [5'-32Р]ДНК из нанокомпозита ТЮ2 • РЬ • ДНК/ПНК от времени. Из рис. 1 видно, что с течением времени происходит десорбция ИиПНКь а радиоактивность в растворе остается постоянной. Это свидетельствует о том, что в основном в раствор уходит ИиПНКь а радиоактивная [5'-32Р]ДНКх остается на твердой фазе.
Таким образом, полученные кинетические данные свидетельствуют, что десорбция ПНК из состава нанокомпозита происходит не за счет десорбции ДНК/ПНК-дуплекса, иммобилизованного на на-ночастицах ТЮ2, а за счет денатурации этого дуплекса, с высвобождением в раствор ПНК.
Для того чтобы определить скорость десорбции ПНК из нанокомпозитов в зависимости от числа перекрывающихся комплементарных оснований в ДНК/ПНК-дуплексе, иммобилизованном на наночастицах, была исследована кинетика десорбции ПНК из нанокомпозитов ТЮ2*РЬ*Р1, ТЮ2 • РЬ • Р2, ТЮ2 • РЬ • Р3 и ТЮ2 • РЬ • Р4.
При нарушении термодинамического равновесия ДНК/ПНК-дуплекс в составе ТЮ2 • РЬ • ДНК/ПНК-нанокомпозита должен диссоциировать с образованием свободной ПНК и композита ТЮ2 • РЬ • ДНК с некоторой кажущейся (наблюдаемой) константой ско
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.