БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 1 * 1993
УДК 577.112.6.012.6:543.422.25
© 1993 Т. А. Балашова, В. С. Пашков, Д. Е. Нольде, Л. В. Оноприенко, И. И. Михалева, Л. В. Самохвалова, Г. В. Малахова, А. С. Арсеньев
КОНФОРМАЦИЯ ФРАГМЕНТА 66—72 ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В КОМПЛЕКСЕ С МОНОКЛОНАЛЬНЫМ АНТИТЕЛОМ К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-2
Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН, Москва
Проанализированы спектры 'Н-ЯМР синтетического фрагаента Ac-Leu66-GIu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu72-OCH3 интерлейкина-2 человека в отсутствие и в присутствии мопоклонального антитела. Согласно полученным данным, в водном растворе пептид имеет развернутую неупорядоченную конформацию. Расчеты, основанные на результатах измерения величин кросс-пиков ЯЭО в спектрах NOESY смеси пептид — антитело, позволили определить пространственное строение связанного с антителом пептида (близко к «к-спирали), а также выявить наличие гидрофобного и гидрофильного
кластеров на противоположных сторонах поверхности связанного с антителом пептида. Гидрофобный кластер контактирует с поверхностью антитела, а гидрофильный экспонирован в растворитель. В присутствии антитела происходит тдролиз С-концевой метоксильной группы пептида, что, несколько понижая аффинность пептида к антителу, не влияет на конформацию пептида и комплексе с антителом.
Исследование межмолекулярных взаимодействий, возникающих при формировании комплексов антиген — антитело, имеет фундаментальное значение для установления принципов, лежащих в основе химической комплементарности и специфичности реакций, протекающих в живых организмах. Основываясь главным образом на результатах рентгеноструктурного анализа комплексов Fab-фрагментов антител с гаптенами [1 ] и лизоцимом [2], установили, что специфичность и высокая аффинность взаимодействия антиген — антитело обусловлены стериче-ским соответствием участков связывания и образованием в области контакта многочисленных взаимодействий (водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимодействия). Природа этих взаимодействий пока еще недостаточно широко исследована для проведения обобщений, позволяющих на основании первичной структуры антитела предсказать его антигенную специфичность [3 ]. Для выяснения механизма связывания антигена с антителом существенное значение имеет выявление взаимодействий, приводящих к связыванию антигена с антителом, а также установление конформации молекулы антигена в комплексе антиген — антитело.
Недавно [4] методом спектроскопии 'Н-ЯМР мы исследовали взаимодействие между моноклональным антителом ЛНКБ-2 (или его Fab-фрагментом) и 10 синтетическими пептидами, соответствующими участку 59—78 полипептидной цепи интерлейкина-2. Результаты этого исследования показали, что взаимодействие пептид — антитело имеет гидрофобный характер —- в связывании с антителом (Fab-фрагментом) участвуют метальные группы остатков Leu66'70,11, Val6® и Ala73 интерлейкина-2; минимальным фрагментом молекулы интерлейкина-2,
Химические сдвиги (<5, м. д.) и КССВ (3/мн-с"и, Гц) протонов пептида (I) в смеси пептид — антитело (»30: 1) в НгО, рН 5,57, 30' С*
Остаток <5, м. д. 3 г а Д'Н-С Н, Гц
NH C'H cfn CyH Другие
СОСНз СНз 2,02
Leu66 8,22 4,30 1,61 1,66 С^Нз 0,90; 0,95 6,3
GIu67 8,49 (8,47) 4,25 (4,27) 1,93; 2,04 2,26 6,1
Glu6S 8,34 (8,33) 4,28 1,93; 2,02 2,20 2,24 6,6
Val69 8,12 (8,16) 4,07 (4,09) 2,07 (2,06) 0,93 0,96 7,3
Leu70 8,26 (8,30) 4,35 (4,39) 1,63; 1,68 1,62 С'Нз 0,88; 0,95 6,8
Asn71 8,38 (8,36) 4,75 2,71; 2,81 (2,70) (2,82) N^H2 6,86; 7,57 7,7
т 72 Leu 8,22 (7,78) 4,42 (4,18) 1,67 (1,59) 1,61 С*Нз 0,87; 0,94 7,3
ОСНз СНз 3,78
В скобках приведены химические сдвиги протонов пептида (II), не совпадающие с химическими сдвигами эквивалентных по структуре протонов пептида (I).
сохраняющим способность связываться с антителом, является фрагмент -Leu70-Asn7'-Leu72-.
В настоящей работе определена конформация синтетического пептида Ас-Leus6-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu72-OCH3 (I) в комплексе с моноклональным антителом ЛНКБ-2.
Анализ спектров DQF-COSY и НОН ANA MLEV-17 пептида позволил идентифицировать сигналы от протонов спиновых систем индивидуальных аминокислотных остатков. Синглетные сигналы от протонов ацетильной (2,05 м. д.) и метоксильной (3,78 м. д.) групп, а также амидной группы боковой цепи остатка Asn (7,57 и 6,86 м. д.) обладают характерными для этих групп химическими сдвигами, и их идентификация в спектрах не вызвала затруднений. Отнесение сигналов от протонов индивидуальных аминокислотных остатков к положению в первичной структуре молекулы белка или пептида обычно основывается на результатах анализа связей i + 1 ], dßN[i, i + 1 ], <iNN[i, i + 1 ], отвечающих
наличию кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) между протоном NH (i + 1)-го остатка и соответственно протонами СаН, СаН, a-NH г-го в первичной структуре остатка [5, 6 ]. В спектрах NOESY водных растворов пептида кросс-пики ЯЭО не проявлялись даже при величинах тт = 600 мс, что типично для водных растворов пептидов подобного размера [7 ]. Поэтому соотнесение спиновых систем протонов аминокислотных остатков с аминокислотной последовательностью пептида выполнено при анализе спектров ROESY [8, 9] с тт = 300 и 400 мс. Полное отнесение сигналов в спектрах 'Н-ЯМР пептида приведено в табл. 1.
Представление о вторичной структуре пептида в растворе можно получить из оценки интенсивностей кросс-пиков ЯЭО между протонами основной цепи и констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) протонов NH'-CaH [10, 11]. В ROESY-спектрах пептида наблюдаются интенсивные кросс-пики между протоном С'Н г-го остатка и протоном NH ; + 1-го остатка (см. рис. 1а). Этот факт,
Ьеи66 С1и67 С1и68 Уа169 Ьеи70 Азп71 Ьеи72
[1,1 + 1]
^[1,1 + 1]
<^[1,1 + 1]
Ьеи66 С1и°' С1иои Уаг"' Ьеи Авп" Ьеи * * *
.67
.68
69 т _ 70
71
72
[1,1 + 1]
^[1-1 + 1]
<^[1^ + 3]
Л^ [1,1+3]
(1,1 + 3]
<^[1,1+4]
Рис. 1. ¿-Связи, наблюдавшиеся в спектре (г,„ = 400 мс) свободного пептида (I) (а) и в
спектре ¡ЧОЕвУ (г,„ = 300 мс) смеси пептид — антитело ( = 30 : 1) (б). Толщина линии, отвечающей ¿-связи, характеризует величину (большая, средняя и малая) соответствующего кросс-пика ЯЭО. Номера аминокислотных остатков соответствуют аминокислотной последовательности интерлейкина-2. Звездочкой помечены ¿-связи, кросс-пики которых были неоднозначно идентифицированы на начальных этапах анализа копформации пептида. Несколько (¡рм [г, г) -связей, наблюдавшихся в спектре ЖОЕЗУ, показаны двумя линиями, характеризующими величины по отдельности измеренных в спектре кросс-пиков между протонами >1Н и СтН, 1ЧН и сР Н
а также значения КССВ протонов ЫН-СН, лежащие в диапазоне 6,1—7,7 Гд (см. табл. 1), свидетельствуют о том, что в водных растворах пептид имеет развернутую неупорядоченную конформацию.
В присутствии антитела сигналы протонов пептида существенно уширяются.
1.2 1,1 1,0 0,9 О,В 0,7 И.Д.
Рис. 2. Сигналы от метильных протонов в спектре 'Н-ЯМР пептида (I) в отсутствие (а) и в присутствии (б) антитела при соотношении молярных концентраций пептид — антитело (—30 : : I)
По мере возрастания концентрации пептида уширение уменьшается, но остается заметным даже при молярном соотношении пептид — антитело —30 : 1 (см. рис. 2). Это свидетельствует о быстром в шкале времени ЯМР обмене молекул пептида между свободным и связанным с антителом состояниями [12, 13]. Быстрый обмен пептида между свободным и связанным с антителом состояниями приводит к тому, что сигналы от протонов пептида в свободном и связанном в комплекс состояниях сливаются, образуя один набор сигналов пептида. Параметры образовавшихся таким образом сигналов пептида (ширина сигнала, химический сдвиг, константы спин-спинового взаимодействия и т. д.) по мере увеличения фракции свободного пептида приближаются к параметрам сигналов пептида в отсутствие антитела. Эффект быстрого обмена пептида между свободным и связанным состояниями был использован в данной работе для облегчения идентификации кросс-пиков ЯЭО между протонами пептида в спектрах ЫОЕБУ смеси пептид — антитело. В этих спектрах, полученных в условиях существенного преобладания фракции пептида в свободном состоянии, на фоне широких кросс-пиков ЯЭО протонов антитела достаточно легко идентифицировать узкие кросс-пики ЯЭО пептида. В отличие от свободного пептида в смеси пептида с антителом в спектрах ИОЕБУ наблюдаются кросс-пики ЯЭО отрицательной интенсивности. Возникновение этих кросс-пиков обусловлено высокой скоростью кросс-релаксации между пространственно сближенными протонами комплекса пептид —
Рис. 3. Область (<У|, о>г = 7,5—8,6 м. д.) спектра NOESY (тт = 300 мс) смеси пептид —
антитело (~30 : 1), рН 5,57, 30° С. Номера остатков соответствуют аминокислотной последовательности интерлейкина-2. Кросс-пики ЯЭО пептида (II) помечены звездочкой
антитело, что типично для макромолекул [141. В спектрах ЫОЕБУ смеси пептид — антитело следует ожидать появления кросс-пиков, обусловленных кросс-релаксацией между: 1) протонами антитела; 2) протонами антитела и протонами связанного с антителом пептида; 3) между протонами пептида, находящегося в комплексе с антителом. Кросс-релаксация между протонами свободного пептида не вносит вклад в интенсивность кросс-пиков в спектре ЫОЕйУ, что отмечалось выше при обсуждении спектров ]ЧОЕ5У пептида в отсутствие антитела.
Идентификация кросс-пиков ЯЭО, отвечающих протонам пептида, в спектрах ЫОЕБУ смеси пептид — антитело была начата с наиболее разрешенной и, следовательно, наиболее легко интерпретируемой области спектра, в которой расположены кросс-пики ЯЭО от протонов N11. В этой области были обнаружены две группы подобных по ширине кросс-пиков ЯЭО (см. рис. 3). Кросс-пики второй группы, едва заметные в свежеприготовленной смеси пептид — антитело, по мере стояния образца становились более интенсивными, тогда как кросс-пики первой группы уменьшались. Для установления природы изменений, которые пептид претерпевает в присутствии антитела, на 6-й день после приготовления смеси пептид — антитело был снят спектр HOHANA МЬЕУ-17. Анализ этого спектра позволил идентифицировать крос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.