ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 10, с. 1332-1340
== МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА =
УДК 575.22:595.773.4
КОНСЕРВАТИВНЫЙ ФАКТОР E(y)2/Susl ВХОДИТ В СОСТАВ
SAGA-КОМПЛЕКСА, а также нового ассоциированного
С ЯДЕРНОЙ ПОРОЙ КОМПЛЕКСА У Drosophila
© 2009 г. М. М. Куршакова1, Д. В. Копытова1, Е. Н. Набирочкина1, 2, Ю. В. Николенко1, Ю. В. Шидловский1, С. Г. Георгиева1, 2' 3, А. Н. Краснов1, 2
1Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: krasnov@go.ru 2Центр медицинских исследований Университета Осло, Москва 119334 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва 119991
Поступила в редакцию 04.07.2008 г.
Окончательный вариант получен 13.11.2008 г.
SAGA/TFTC-комплекс играет важную роль в регуляции транскрипции. Нами была исследована важность положения гена в ядре для его транскрипции и последующего экспорта вновь образованной мРНК. Было показано, что белок Е(у)2 является субъединицей SAGA/TFTC - гистонацетилтрансферазного комплекса у Drosophila и что Е(у)2 располагается на периферии ядра. Продемонстрировано взаимодействие между Е(у)2 и комплексом ядерных пор (NPC) и что SAGA/TFTC-комплекс также контактирует с NPC на периферии ядра. Кроме того, NPC формирует комплекс с белком Xmas-2 (X-linked male sterile 2) как при нормальных условиях, так и после теплового шока. Необходимо отметить, что при "выключении" синтеза Е(у)2 и Xmas-2 снижается контакт между локусами гена, кодирующего белок теплового шока 70 (hsp70), и оболочкой ядра до и после активации, что препятствует транскрипции. Таким образом, Е(у)2 и Xmas-2 вместе с SAGA/TFTC -комплексом участвуют в прикреплении группы сайтов транскрипции к NPC, что обеспечивает эффективную транскрипцию и экспорт мРНК.
Ранее периферию ядра считали транскрипци-онно неактивным ядерным участком. Такой вывод позволили сделать работы, выполненные на дрожжах ЗассНаготусе8 cerevisiae. В них было показано, что теломеры формируют кластеры на периферии ядра, что приводит к "молчанию" генов [1]. Аналогично было показано, что несколько неактивных генов человека ассоциируются с периферией ядра и перинуклеарным гетерохро-матином, в то время как во время их транскрипционной стадии они располагаются внутри ядра [2]. Ламина на периферии ядра связана с хроматином и, как считают, участвует в его организации. Поиск генов, ассоциированных с В-типом ламины, показал, что связанные с ним гены транскрипци-онно неактивны [3]. Интересны результаты экспериментов, полученные на дрожжах: связывание группы генов с комплексом ядерных пор ^РС) может значительно изменять их активность. Таким образом, №"С можно считать новым интеграционным участником экспрессии генов [4].
Существуют неоспоримые доказательства того, что различные процессы, вовлеченные в синтез, биогенез и экспорт мРНК, тесно связаны между собой. Общие факторы транскрипции РНК-полимеразы II и сама полимераза II играют центральную роль во всех этих процессах [5]. Недавние исследования выявили дополнительные факторы экспорта мРНК, которые связывают
РНК-полимеразу II и экспорт мРНК. Фактор Sac3 дрожжей был выявлен при скрининге летальных мутаций как компонент TREX (transcription and export) комплекса экспорта мРНК [6]. Sac3 формирует комплекс с Thpl [7] и делеция Sac3 или Thpl приводит к нарушениям в экспорте поли(А)+РНК.
Е(у)2 был выявлен в процессе поиска генов, участвующих во взаимодействии между энхансе-ром и промотором [8]. Е(у)2 кодирует небольшой эволюционно консервативный белок Drosophila, состоящий из 101 аминокислоты, который присутствует во всех тканях, локализован в ядре и ассоциирован со многими сайтами политенных хромосом, что позволяет предположить, что он играет важную роль в регуляции экспрессии генов [9]. Генетические и биохимические эксперименты показали, что Е(у)2 у Drosophila является компонентом SAGA/TFTC - гистонацетилтрансферазного коактиваторного комплекса, участвующего в ремоделировании хроматина и активации группы генов [10, 11]. Гомолог Е(у)2 у дрожжей, позднее названный Sus1, как было установлено, является компонентом как SAGA, так и Sac3-Thp1-комплекса экспорта мРНК [12]. Эти данные позволили предположить связь между экспрессией SA-GA-зависимых генов и экспортом мРНК у дрожжей.
Цель данной работы - исследование локализации гена hsp7G в ядре, его транскрипции и экспорта мPHK у метазоа на примере Drosophila.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты в двyгuбpuднoй системе дрожжей. Е(у)2, сшитый с C-концом LexA и встроенный в рВТМ117, был использован для скрининга библиотеки, содержащей 1 x 107 клонов, сшитых с GAL4-активирующим доменом в векторе рACT2. В экспериментах была использована линия дрожжей Lc40c [13]. Aктивацию репортерного гена LacZ оценивали с использованием в качестве субстрата CPRG. Ложно-позитивные сигналы исключали с помощью стандартной процедуры (Clontech).
Экcnpеccupyющuе вектора. кДИ^ Xmas-2 (7551370 аминокислот) была соединена с тремя N-кон-цевыми FLAG-эпитопами и клонирована в экспрес-сирующий вектор рAC5.1v5His ("Invitrogen").
Эксперименты по РНК-интерференции (РНКи). Эксперименты по PHKn были выполнены как описано ранее [14]. мPHK E(y)2 была синтезирована с использованием набора реактивов Ambion MEGA script.
Антитела. Были использованы следующие антитела: полученные в нашей лаборатории кроличьи антитела и мышиные антитела против E(y)2, кроличьи антитела против GCN5 и Xmas-2; антитела против TAF10 [15], любезно предоставленные L.Tora. Также были использованы антитела против TAF1, TRRAP [1б] и ADA2b [10] и антитела против ламина DmO (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Department of Biological Sciences), антитела к NPC-компонентам Mab4l4 ("Abcam"), антитела к FLAG-тагу ("Sigma"). Все полученные антитела были аффинно очищены.
Пoлyченuе ядерных экстрактов, uммyнonpе-ципитация, uммyнooкpaшuвaнuе. Ядерный экстракт получали и проводили эксперименты по ко-иммунопреципитации как описано ранее [9]. Фиксацию и приготовление политенных хромосом, их окрашивание выполняли как описано в [17] Мышиные антитела против E(y)2 и кроличьи антитела против GCN5 и Xmas-2 были использованы для колокализации. Для экспериментов по иммуно-окрашиванию клетки S2 выращивали на стеклах, отмывали дважды в 1xPBS, фиксировали в 3.7%-ном ПФA в течение 10 мин, обрабатывали 5 мин 0.2%-ным Triton X-100 и блокировали в 3%-ном обезжиренном молоке/lxPBS в течение 10 мин. Окрашивали первичными антителами 1 час при комнатной температуре во влажной камере. В качестве вторичных антител использовали: антитела против IgG (H + L) кролика, конъюгированные с Cy3 ("Amersham"), антитела против IgG мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488 ("Molecular
Probes"). После инкубации отмывали препараты 3 раза по 10 мин в TBS и инкубировали с DAPI ("Sigma"). Промывали препараты в TBS 5 мин и заключали в Vectashield ("Vector Laboratories"). Результаты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica DMR/HC5, оснащенного объективом HCX PZ Fluotar 100x/1.3 и камерой CCD DC 350 F.
РНК in situ гибридизация с Cy3-oligo-dT-npaü-мером. Прикрепившиеся к покровным стеклам S2-клетки фиксировали 3.7%-ным ПФА 10 мин. Затем проводили предгибридизацию 15 мин при комнатной температуре в растворе 2xSSC (3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H5O7) с 20% формамида. Су3-ме-ченный oligo-dT-праймер длиной в 50 пн ("Син-тол") растворяли в гибридизационном растворе (2xSSC, 20%-ный формамид, 10% декстрансуль-фата, 1 мкг/мкл тРНК дрожжей, 5 мкг/мкл BSA) в концентрации 0.4 пмоль/мкл, гибридизацию проводили в 10 мкл раствора в течение ночи при 37°С во влажной камере. Промывали препараты в следующих растворах: при 42°С - три раза по 5 мин в 2xSSC/20%-ный формамид, три раза по 5 мин в 2xSSC, один раз 5 мин в 1xSSC; при комнатной температуре - один раз 5 мин в PBS. Затем инкубировали препараты в 3%-ном обезжиренном сухом молоке, разведенном на PBS, и проводили иммуноокрашивание клеток антителами к ламину Dm0 в соответствии с описанным выше протоколом.
ДНК in situ гибридизация с зондом к индивидуальному гену. Прикрепившиеся к покровным стеклам S2-клетки фиксировали в растворе (3.7% ПФА, 50 мМ MgCl2, 1xPBS) 10 мин. Промывали препараты PBS три раза по 5 мин, затем охлажденными спиртовыми растворами 70%, 80%, 96% по 5 минут каждым. Сначала обрабатывали препараты РНКазой А (в 2xSSC, 100 мкг/мл) 1 час при 37°С. После промывки три раза по 5 мин в 2xSSC препараты инкубировали в 0.01%-ном пепсине (в 10 мМ HCl) 10 мин при 37°С. Промывали два раза PBS по 5 мин, один раз PBS/50 мМ MgCl2 5 мин. Проводили постфиксацию раствором (1% ПФА, 50 мМ MgCl2, 1xPBS) 10 мин при комнатной температуре. Промывали препараты три раза PBS по 5 мин, затем охлажденными спиртовыми растворами. В качестве зондов использовали следующие фрагменты: для hsp70-гено, - ПЦР-фрагмент длиной 2405 пн, для tr/2-гена - полноразмерную кДНК (DQ162845) в векторе pBlue-ScriptII SK-. Пробы были помечены биотинили-рованным 16-dUTP с использованием Biotin-Nick Translation Mix ("Roche") по протоколу производителя. Пробу переосаждали и растворяли в гибридизационном растворе (2xSSC, 50%-ный формамид, 1%-ный Tween-20, 10% декстрансульфата, 1 мкг/мкл тРНК дрожжей и 0.5 мкг/мкл ДНК спермы лосося, обработанной ультразвуком) в конечной концентрации 2-5 нг/мкл. 10 мкл полу-
ченного раствора наслаивали на препарат, прогревали при 75°С 5 мин и гибридизовали ночь при 37°С во влажной камере. Последовательно промывали препараты в следующих растворах: при комнатной температуре - 10 мин в 2xSSC, при 45°С - два раза по 10 мин в 2xSSC/50%-ный фор-мамид, при 55°С - 5 мин в 0.1xSSC. Для визуализации полученных препаратов гибридизовавшиеся пробы обрабатывали тремя последовательными инкубациями препаратов с авидином, меченным TRITC ("Invitrogen") (в разведении 1 : 100), и антителами к авидину, меченными биотином ("Vector Laboratories") (в разведении 1 : 100). Между инкубациями препараты промывали три раза по 5 мин раствором 4xSSC/0.05% Tween-20. ДНК окрашивали DAPI. Промывали препараты в PBS 5 мин и заключали в Vectashield ("Vector Laboratories"). Результаты анализировали при помощи конфокального
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.