ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:577.214.625:578.853
КОНСТИТУТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ARGOS В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА © 2011 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, А. А. Ильясова, А. В. Чемерис
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа
Поступила в редакцию 15.10.2010 г.
Ауксин-индуцибельный ген ARGOS Arabidopsis thaliana экспрессируется в растущих тканях и контролирует величину органов посредством регулирования пролиферации и меристематической компетентности клеток. Промотор вируса мозаики георгина (Dahlia pinnata Cav.) сходен по ряду параметров с широко известным 35S промотором вируса мозаики цветной капусты, однако обладает более высокой активностью в трансгенных растениях табака (Nicotiana tabacum L.). Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген ARGOS арабидопсиса под контролем промотора вируса мозаики георгина. Часть полученных в ходе работы трансгенных растений табака поколения Т0 отличались ускорением перехода в фазу цветения, небольшим увеличением размера цветков и существенным увеличением размера листьев. Трансгенные растения поколения Ti росли быстрее, имели заметно увеличенные листья и немного увеличенные цветки по сравнению с нетрансгенны-ми растениями табака. Стабильность и наследование трансгена, а также выявленные фенотипиче-ские особенности были показаны и для растений поколения Т2.
Ключевые слова: Dahlia pinnata — Nicotiana tabacum — трансгенные растения — ARGOS — AJNTEGU-MENTA — CYCLJND3;1 — транскрипционный фактор — промотор вируса мозаики георгина — регуляция роста — величина органов
ВВЕДЕНИЕ
В растениях за размеры, пропорции и симметрию органов отвечают различные гены, некоторые из которых уже исследованы. Величина органов растений является важной морфологической характеристикой и находится под жестким генетическим контролем, хотя надо учитывать, что на него влияют и условия внешней среды. Размеры органов растений контролируются тремя основными механизмами, а именно регуляцией клеточной пролиферации, клеточного растяжения и влиянием на процессы эндоредупликации. На клеточное растяжение оказывают влияние такие гены, как AtEXP10, АЮВЕ1, ЛИЕ и другие [1, 2], на эндоредупликацию гены, кодирующие компоненты ДНК-топоизомеразного комплекса VI, например, ЯИЫ [3]. Интерес привлекают гены, регулирующие клеточную пролиферацию, так как было выяснено, что именно изменение уровня экспрессии этих генов приводит к наиболее значительному увеличению размеров органов у растений. Одним из первых генов-регуляторов величины органов растений, контролирующих клеточную пролиферацию, был изучен ген Л1МТЕОиМЕМТЛ ЛгаЫйор$15 ЛаНапа. Было пока-
Адрес для корреспонденции: Кулуев Булат Разяпович. 450054 Уфа, Проспект Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Электронная почта: Kuluev@bk.ru
зано, что этот ген кодирует транскрипционный фактор подкласса АР2 семейства AP2/ERF [4] и повышенная экспрессия его в трансгенных растениях не только арабидопсиса, но и не родственного табака приводит к значительному увеличению всех органов растения с сохранением пропорций и симметрии [5]. Через некоторое время был исследован ген ARGOS (Auxin-Regulated Gene Involved in Organ Size), экспрессия которого индуцируется ауксином, т.е. в цепочке регуляторов роста он оказался ниже гена AXR1 [2]. Было показано, что белковый продукт этого гена является транскрипционным фактором гена AINTEGU-MENTA и эктопическая экспрессия его также приводит к значительному увеличению всех надземных органов у арабидопсиса. Определяющим фактором увеличения размера органов в трансгенных растениях с повышенной экспрессией генов AINTEGUMENTA и ARGOS по сравнению с обычными растениями является более длительное сохранение меристематической компетентности клеток и более длительное поддержание их в центре апикальной и боковой меристем [2, 5]. Таким образом, благодаря повышенной экспрессии этих генов в органах увеличивается количество клеток и удлиняется время роста. Было высказано предположение, что ген ARGOS является видоспецифичным для арабидопсиса [2], однако через некоторое время этот ген был обнаружен и
исследован у китайской капусты [6]. Было доказано, что этот ген выполняет одинаковые функции как в арабидопсисе, так и в китайской капусте. Большой интерес представляет также ген СYCLIND3;1, который является одним из основных регуляторов клеточного деления; он способствует поддержанию клеток органа на стадии S, в связи с чем его сверхэкспрессия приводит к увеличению количества недифференцированных клеток в органе. Оказалось, что одним из транскрипционных факторов, увеличивающих уровень экспрессии этого гена, является AINTEGU-MENTA, однако трансгенные по гену СYCLIND3;1 растения, вопреки ожиданиям, не отличались увеличенными органами, так как в растениях существуют компенсаторные механизмы регуляции клеточной экспансии [7]. К тому же, у AINTEGU-MENTA, видимо, есть и другие ДНК-мишени, белковые продукты которых регулируют не клеточное деление, а пролонгируют меристематиче-скую компетентность клеток органа, однако эти гены пока остаются не известными.
Из трех перечисленных генов мы выбрали для исследований ген ARGOS, так как он характеризуется малым размером, что дает преимущества при молекулярно-биологических манипуляциях, к тому же, его эктопическую экспрессию на табаке еще не проверяли, в отличие от генов AINTEGU-MENTA и СYCLIND3;1 [5, 8].
Промотор вируса мозаики георгина был впервые выделен и исследован нами ранее [9]. Этот промотор показал высокую активность в протопластах и трансгенных растениях табака [9]. Мы показали, что в трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина в 1.7 раза сильнее классического 35S промотора [10]. Использование этого промотора может способствовать более высокому уровню экспрессии целевого гена, чем при применении 35S промотора, и, тем самым, может привести к более заметному увеличению размеров органов. В настоящей работе мы приводим результаты работы по конструированию бинарного вектора с промотором вируса мозаики георгина и получению на основе этого вектора трансгенных растений табака, экспрессиру-ющих ген ARGOS арабидопсиса. В результате проведенной работы было показано, что эктопическая экспрессия гена ARGOS в табаке приводила к ускорению роста и увеличению размеров надземных органов. Однако в отличие от араби-допсиса в табаке нами не было зафиксировано удлинение времени роста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные клетки, штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции, последовательности олигонуклеотидных праймеров
В работе использованы бактерии Escherichia coli штамма XL1-Blue и Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0. Из плазмид использовали Т-век-тор pKRX и бинарный вектор pCambia 2301 с геном устойчивости к канамицину и репортерным геном GUS ("CAMBIA", Австралия). Тотальную ДНК арабидопсиса выделяли методом солевой экстракции [11]. Выделенную таким образом ДНК арабидопсиса очищали при помощи набора для очистки ДНК фирмы "Цитокин" (Россия) и использовали в качестве матрицы при проведении ПЦР. Тотальную РНК выделяли при помощи тризола фирмы "Invitrogen" (США). ОТ—ПЦР осуществляли при помощи MuLV-обратной тран-скриптазы ("Fermentas", Литва). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний при помощи набора фирмы "Цитокин". Расщепление ДНК проводили при помощи различных эндонуклеаз рестрикции в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками ("Сибэнзим", Россия; "Fermentas"). Лиги-рование осуществляли при помощи Т4 ДНК-ли-газы ("Силекс", Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. Ага-розный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI ("Bio-Rad", США). Элюцию фрагментов ДНК проводили из легкоплавкой агарозы или при помощи набора для очистки ДНК ("Цитокин"). Для ПЦР использовали амплификаторы производства компании "ДНК-технология" (Россия). Промотор вируса мозаики георгина выделили из тотальной ДНК инфицированного георгина перистого (Dahlia pinnata Cav.) при помощи праймеров DMVF AT-CAACGGAGAAACAAAGAT и DMVR ATGGGT-TACTACTCACACAT, при этом размер его составил 442 п.н. Для амплификации гена ARGOS размером 732 п.н. использовали праймеры ArgF TTGTCTTCCTCATTTCCCTAC и ArgR ATCAT-CATATAATAAATTTCAGAT. Для получения ам-плификатов гена ARGOS с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-полимеразу ("Сибэнзим"), для "затупления" липких концов после рестрикции или амплификации использовали Т4-ДНК-полимеразу ("Сибэнзим"). Для поиска целевых клонов при модифицировании вектора pCambia 2301 использовали праймер polyAR: GCATGC-CTGCAGGTCACTGG в паре с праймером DM-VF. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США). Подготовку и трансформацию компетентных клеток E. coli осу-
ществляли по методу Cohen с соавт. [12]. Электро-порацию компетентных клеток A. tumefaciens проводили при помощи электропоратора фирмы "Bio-Rad" модели Micropulser. Поиск гомологичных генов осуществляли при помощи программ MegAlighn пакета Lasergene ("DNASTAR", США) и программы MegaBlast, доступной через сайт http:// www.ncbi.nlm.nih.gov.
Получение трансгенных растений табака
Трансгенные формы табака (Nicotiana tabacum L.) получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков [13]. Были использованы листья растения N. tabacum сорта SR-1 2-месячного возраста. Листья промывали 70% спиртом, далее проводили стерилизацию 10% раствором коммерческого отбеливателя с добавлением Tween 20 в течение не более 15 мин, затем промывали листья стерильной дистиллированной водой. Листья переносили в стерильные чашки Петри и стерильным скальпелем нарезали отдельные экспланты размером приблизительно 0.5 х 0.5 см без крупных жилок. Готовые экспланты переносили на чашки со средой для регенерации, содержавшие по 20—25 мл среды MSD4x2 (соли МС с добавлением НУК — 0.1 мг/мл, 6-БАП — 1 мг/мл, сахарозы 30 000 мг/л, рН 5.8). Далее наливали в стерильную чашку 10 мл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.