ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 4, с. 623-632
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1:577.214.625:578.853
КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИБРИДНЫХ ПРОМОТОРОВ КАУЛИМОВИРУСОВ И АНАЛИЗ ИХ АКТИВНОСТИ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ © 2010 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, Я. П. Лебедев, А. А. Ильясова, А. В. Чемерис
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа
Поступила в редакцию 30.09.2009 г.
Методами ДНК-шаффлинга, ПЦР и рестрикции—лигирования получены гибридные формы промоторов вируса мозаики цветной капусты (Brassica oleracea) (ВМЦК), вируса мозаики георгина (Dahliapinnata) (ВМГ) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (Dianthus caryophillus) (ВКГГ) в различных комбинациях. 12 гибридных промоторов клонировали в бинарных векторах pCambia с ре-портерным геном GUS и флюориметрическим методом определяли их активность в трансгенных растениях табака (Nicotiana tabacum). В качестве контроля были использованы 35S промотор, промотор ВМГ размером 442 п.н. и промоторы ВКГГ размером 371 и 501 п.н. 7 из проанализированных промоторов показали большую, а 7 — меньшую, чем 35S промотор, силу в трансгенных растениях табака. Наибольшую активность показал природный промотор ВМГ, а наименьшую — природный промотор ВКГГ размером 501 п.н. Активность промотора ВКГГ размером 371 п.н. оказалась примерно равной силе 35S промотора.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum — 35S промотор — каулимовирус — вирус мозаики георгина — ДНК-полимераза фага phi 29 — ДНК-шаффлинг — активность промотора
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на все более широкое распространение тканеспецифичных и индуцибельных промоторов в генной инженерии растений [1, 2], конститутивные промоторы также не теряют своей значимости и довольно часто применяются как в фундаментальных исследованиях, так и в прикладных целях [3, 4]. Среди конститутивных промоторов одним из самых известных и распространенных является 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), который показал высокую эффективность и отсутствие тканеспеци-фичности в клетках как двудольных, так и однодольных растений [5, 6]. Однако для некоторых целей силы данного промотора оказалось недостаточно, особенно это актуально при использовании трансгенных растений в качестве продуцентов физиологически активных веществ [7]. В других же случаях, например, при сверхэкспрессии важных для регуляции роста и развития рас-
Сокращения: ВКГГ — вирус кольцевой гравировки гвоздики; ВМГ — вирус мозаики георгина; ВМЦК — вирус мозаики цветной капусты; GUS — ß-глюкуронидаза; 4-MU — 4-мети-лумбеллиферил^-глюкуронид; X-Gluc — 5-бром-4-хлор-3-индолил^-В-глюкуронид.
Адрес для корреспонденции: Кулуев Булат Разяпович. 450054 Уфа, Проспект Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Факс: 8 (347) 235-60-88; электронная почта: Kuluev@bk.ru
тений факторов, когда значительное накопление целевого белкового продукта может играть отрицательную роль, возникает необходимость в применении более слабых конститутивных промоторов из-за высокой вероятности летальности трансгенного растения или приобретения им стерильности [8]. Кроме того, 35S промотор во многих бинарных векторах контролирует не только экспрессию целевого гена, но часто селективного и маркерного генов. При получении трансгенных по нескольким генам растений число копий 35S промотора возрастает уже многократно, что может приводить к уменьшению уровня экспрессии, ввиду того, что с энхансерной областью данного промотора взаимодействуют одни и те же физиологически актив -ные транскрипционные факторы, ресурс которых может быть исчерпаем. В некоторых случаях описанный выше процесс может приводить к так называемому "молчанию" трансгена. Поэтому для исследователя, работающего над созданием большого количества различных трансгенных растений, представляется важным иметь целый ряд конститутивных промоторов, отличающихся как по экспрессионной активности, так и по последовательности нуклеотидов.
Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro. Представляет особую
важность создание гибридных форм промоторов методом ДНК-шаффлинга — высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала, с кодированием гомологичных белков или их доменов [9], а также промоторных последовательностей [10]. Для проведения экспериментов по направленной молекулярной эволюции in vitro с использованием большинства методов необходимым условием является наличие гомологии между нуклеотидными последовательностями [9]. Одной из трудностей при проведении ДНК-шаффлинга является преимущественное восстановление родительских последовательностей, однако предложенный подход с использованием фрагментов одноцепочечной ДНК заметно повысил эффективность получения гибридных молекул [11]. Ранее нами были выделены и исследованы промоторы вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ) размером 371 п.н. (6721—7091 в координатах генома ВКГГ, номер доступа в Ген-банке X04658.1) и 501 п.н. (6721-7221 в координатах генома ВКГГ, номер доступа в Генбанке X04658.1) и вируса мозаики георгина (ВМГ) размером 442 п.н. (номер доступа EF513491) [12, 13]. Однако уровень их гомологии с 35S промотором составил не более 50% и оказался довольно низким для проведения эффективного ДНК-шаф-флинга. По этой причине для подготовки промоторов к ДНК-шаффлингу было решено наработать их в одноцепочечной форме с многократно повторяющейся последовательностью промотор-ного участка без значительной примеси нуклео-тидной последовательности плазмидного вектора. Для этого был использован метод, который заключается в применении амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК поли-меразы фага phi 29. Гибридные формы промоторов каулимовирусов были получены нами также с применением широко распространенных методов молекулярной биологии, таких как ПЦР, расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирования при помощи ДНК-лигазы. Предполагалось, что в результате экспериментов должны быть получены конститутивные промоторы, различающиеся как по нуклеотидной последовательности, так и по экспрессионной активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследований были природные и гибридные промоторы полноразмерного транскрипта вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ) и вируса мозаики георгина (ВМГ). Растениями-хозяевами этих каулимовирусов являются Brassica oleracea — цветная капуста, Dianthus caryo-phillus — гвоздика садовая и Dahlia pinnata — георгин перистый соответственно.
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний при помощи набора фирмы "Цитокин" (Россия). Расщепление ДНК проводили при помощи различных эндо-нуклеаз рестрикции в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками ("Сибэнзим", Россия; "Fermentas", Литва). Лигирование проводили при помощи Т4 ДНК-лигазы ("Силекс", Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% ага-розном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI ("Bio-Rad", США). Фрагменты ДНК элюи-ровали из легкоплавкой агарозы или при помощи набора для очистки ДНК ("Цитокин"). ПЦР проводили в амплификаторе производства компании "ДНК-технология" (Россия) с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus ("Хеликон", Россия). Для получения амплификатов промоторов с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-полиме-разу ("Сибэнзим"). Для амплификации 35S промотора размером 510 п.н. (6930—7439 в координатах генома ВМЦК, номер доступа V00141.1) использовали праймеры: 35SF AGAGGACCTAACAGAACTCG и 35SR CGTGTTCTCTCCAAATGAAA, для амплификации промотора ВМГ: DMVF ATCAACG-GAGAAACAAAGAT и DMVR ATGGGTTAC-TACTCACACAT, для амплификации промотора ВКГГ размером 501 п.н.: CERVF AGAAGATT-TAATGGCAATCC и CERVR AGGACTTAGGCT-CAACACAT Для выделения промотора ВКГГ размером 371 п.н. были использованы праймеры CERVF и CERVR2: TTTTCGATGCCTTAACAATG. Подготовку и трансформацию компетентных клеток Escherichia coli осуществляли по методу Coen с со-авт. [14]. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе "ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" ("Applied Biosystems", США). Электро-порацию компетентных клеток Agrobacterium tumefaciens проводили при помощи электропора-тора фирмы "Bio-Rad" модели Micropulser. Трансгенные формы табака получали методом аг-робактериальной трансформации листовых дисков [15].
Определение активности промотора. Активность промотора определяли путем количественного анализа экспрессии репортерного гена ß-глюкуро-нидазы (GUS) флюориметрическим методом [16]. Для анализа брали замороженные и хранящиеся в течение 1—2 мес. при —70°С листья и стебли трансгенного табака (Nicotiana tabacum) поколения T0, а в некоторых случаях F1. Были использованы лишь растения с устойчивым и высоким уровнем экспрессии репортерного гена GUS во всех тканях, выявленного в ходе гистохимического анализа при помощи хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил^^-глюкуро-нида (X-Gluc).
Растительную ткань растирали в ступке с жидким азотом, помещали в пробирку и добавляли экстрагирующий буфер следующего состава: 50 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7-8, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ ß-меркаптоэтанол, 0.1% SDS, 0.1% Тритон Х-100. Перемешивали и центрифугировали на микроцентрифуге MiniSpin Plus фирмы "Eppendorf" при 14.5 об./мин, 5 мин. Определяли концентрацию белка в приготовленном клеточном экстракте по методу Брэдфорда. В заранее приготовленные микропробирки, содержащие по 200 мкл раствора субстрата (1 мМ 4-метилумбел-лиферил^-глюкуронид (4-MU)) в GUS-экстрак-ционном буфере и прогретые до 37°С, добавляли по 20 мкл белкового экстракта (в двухкратной по-вторности) и быстро перемешивали с помощью встряхивателя для пробирок. Сразу после смешивания к одной из проб добавляли 0.8 мл стоп-рас-твора (0.2 М Na2CO3), которая служила нулевой точкой для определения собственной флюоресценции экстракта. Остальные пробирки инкубировали в течение 20 мин, после чего останавливали реакцию добавлением 0.8 мл стоп-раствора. Содержание 4-MU в полученных растворах определяли с по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.