научная статья по теме КОНСТРУИРОВАНИЕ ЦИАНО-БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНСОРЦИУМА НА ОСНОВЕ АКСЕНИЧНЫХ КУЛЬТУР ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ Биология

Текст научной статьи на тему «КОНСТРУИРОВАНИЕ ЦИАНО-БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНСОРЦИУМА НА ОСНОВЕ АКСЕНИЧНЫХ КУЛЬТУР ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 4, с. 588-595

ПРИКЛАДНЫЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ АСПЕКТЫ

УДК 581.1

КОНСТРУИРОВАНИЕ ЦИАНО-БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНСОРЦИУМА НА ОСНОВЕ АКСЕНИЧНЫХ КУЛЬТУР ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ

© 2013 г. А. А. Жубанова, А. К. Ерназарова, Г. К. Кайырманова, Б. К. Заядан, И. С. Савицкая,

Г. Ж. Абдиева, А. С. Кистаубаева, Н. Ш. Акимбеков

Казахский Национальный университет им. аль-Фараби, Алматы, Казахстан Поступила в редакцию 29.10.2012 г.

Рассмотрены пути создания циано-бактериальных сообществ с высоким ремедиирующим потенциалом для очистки загрязненных нефтью почв и водоемов. Для получения бактериологически чистых (аксеничных) культур цианобактерий (Phormidium sp. К-1, Oscillatoria sp. А-2 и Oscillatoria sp. С-3) была разработана специальная методика. Показано, что 14 штаммов бактерий-спутников этих цианобактерий обладают углеводородокисляющей активностью. Они отнесены к родам Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus. Использование выделенных нами и коллекционных гетеротрофных бактерий-нефтедеструкторов позволило сконструировать искусственные циано-бактериальные сообщества с высокой углеводородокисляющей активностью. В полевых экспериментах на полигоне-накопителе ТОО "Химпромсервис-Актобе" показан высокий ремедиирующий эффект циано-бак-териальных ассоциаций на основе Phormidium sp. К-1 и бактерий-спутников Pseudomonas stutzeri A1, Pseudomonas sp. N2 и P. alcaligenes A5. Полученные результаты являются основой для разработки микробиологических методов защиты окружающей среды с использованием цианобактерий.

Ключевые слова: циано-бактериальные сообщества — биоремедиация — нефтедеструкторы

DOI: 10.7868/S0015330313040192

ВВЕДЕНИЕ

Большинство микроорганизмов способно к биохимическому окислению углеводородов нефти, однако основной вклад в эти процессы вносят микроорганизмы, способные использовать углеводороды в качестве единственного источника углерода [1]. В формировании устойчивого полифункционального сообщества в загрязненных экосистемах большое значение имеет интродукция в них цианобактерий, которые могут создавать условия для развития полифункционального сообщества (цианобактерий, микроводорослей, бактерий, грибов), осуществляющего деградацию загрязняющих веществ. Таким образом, ци-анобактерии повышают эффективность очистки и способствуют биологическому оздоровлению загрязненных сред [2].

Цианобактерии в природе существуют в виде симбиотической ассоциации с гетеротрофными

Сокращения: ПАВ - поверхностно-активные вещества; МПА -мясо-пептонный агар.

Адрес для корреспонденции: Жубанова Ажар Ахметовна. Казахстан, 050040 Алматы, пр. аль-Фараби, 71. Казахский Национальный университет им. аль-Фараби, факультет биологии и биотехнологии. Электронная почта: azhar_1941@mail.ru

микроорганизмами [3]. Эти гетеротрофы могут прочно связываться с клеточной стенкой ци-анобактерий или находиться в слизевом полиса-харидном чехле (гликокаликсе) цианобактерий. Понимание биохимических основ происходящих процессов и дифференциация вклада цианобак-терий и бактерий-спутников в углеводородокис-ляющую активность природного циано-бактери-ального консорциума необходимы при конструировании ассоциатов на основе аксеничных штаммов цианобактерий и гетеротрофных микроорганизмов для создания стабильных систем с максимальной углеводородокисляющей активностью.

Цель данной работы - создание циано-бакте-риальных сообществ с высоким ремедиационным потенциалом в отношении загрязненных нефтью почв и водоемов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований - штаммы цианобакте-рий, отобранные общепринятыми методами, в соответствии с ГОСТ [4, 5], в водоемах Казахстана: 1) из искусственного пруда Кумкольского ме-

сторождения нефти (культура K-1), 2) из оз. Алаколь (культура А-2), 3) из оз. Сарколь (культура С-3), а также активные штаммы углеводородо-кисляющих бактерий из коллекции кафедры биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби (табл. 1).

В качестве единственного источника углерода в питательных средах для культивирования угле-водородокисляющих микроорганизмов использовали: 1) нефть Кумкольского месторождения -легкую (плотность 613.0 кг/м3), малосернистую (0.07% серы), малопарафинистую (1.6% парафинов), с незначительным содержанием асфальте -нов (следы), маловязкую (вязкость при 50°С -3.71 мм2/С), с температурой застывания 10°С и температурой плавления 49°С; 2) дизельное топливо или газойль — топливо для дизельных двигателей, имеет С13-С18 атомов углерода, температура кипения 200-330°С; 3) толуол (метилбензол, метацид) — одноядерный ароматический углеводород (С7Н8).

Для получения бактериологически чистых (ак-сеничных) культур цианобактерий использовали поверхностно-активные вещества (ПАВ) - це-тилпиридиний бромистый и олеат натрия. Суспензию культур в физиологическом растворе обрабатывали катионным ПАВ в определенной концентрации (400-500 мкг/мл) в течение 1 ч, затем клетки отмывали от непрореагировавших молекул ПАВ физиологическим раствором и центрифугировали при 5000 об./мин в течение 5 мин. Процедуру повторяли три раза. Очищенные клетки цианобактерий пересевали на среду Заррука

[6]. Наличие гетеротрофных бактерий определяли с помощью высева на агаризованную питательную среду.

Для выделения и культивирования цианобактерий использовали среды Заррука [6], Громова № 6

[7], М [8] и Е-8 [9]. Суспензию цианобактерий получали встряхиванием культур в колбах со стеклянными бусами на горизонтальном шейкере (Ultra Turbax, Tube Disperser, "IKA-Werke GmbH", Германия) в течение 30-60 мин, при этом большинство колоний разбивалось до отдельных нитей. Кроме культур в виде суспензии, использовали неразрушенные пленки. Численность клеток цианобактерий определяли при помощи прямого счета под микроскопом. Для визуальных наблюдений использовали тринокулярный микроскоп Leka DMLS 2500 ("Leica", Германия).

При составлении консорциумов (цианобактерии + гетеротрофные микроорганизмы) использовали штаммы углеводородокисляющих бактерий из коллекции кафедры микробиологии КазНУ. Численность подсеваемых микроорганизмов определяли путем подсчета КОЕ на мясо-пептонном

Таблица 1. Штаммы цианобактерий и сопутствующих бактерий

№ Шифр Штамм Получен

1 K-1 Phormidium sp.* эта работа

2 A1 Pseudomonas stutzeri* эта работа

3 А2 Pseudomonas sp. эта работа

4 А3 Pseudomonas alcaligenes эта работа

5 А4 Pseudomonas fluorescens эта работа

6 A5 Pseudomonas alcaligenes* эта работа

7 A6 Pseudomonas sp. эта работа

8 A-2 Oscillatoria sp.* эта работа

9 N1 Pseudomonas aeruginosa эта работа

10 N2 Pseudomonas sp.* эта работа

11 N3 Alcaligenes sp. эта работа

12 N4 Arthrobacter sp. эта работа

13 N5 Bacillus sp. эта работа

14 C-3 Oscillatoria sp.* эта работа

15 O1 Pseudomonas pseudoalcaligenes эта работа

16 О2 Pseudomonas sp. эта работа

17 О3 Pseudomonas sp. эта работа

18 H3 P. mendocina * коллекция

19 H10 P. stutzeri* коллекция

20 Н14 P. aeruginosa* коллекция

Циано-бактериальные консорциумы — ассоциации

цианобактерий и сопутствующих бактерий

1 К-1 + A1 + А5 + N2 эта работа

2 К-1 + H3 + H10 + Н14 эта работа

3 A-2 + A1 + А5 + N2 эта работа

4 A-2 + H3 + H10 + Н14 эта работа

5 С-3 + A1 + А5 + N2 эта работа

6 С-3 + H3 + H10 + Н14 эта работа

Примечание. Штаммы цианобактерий подчеркнуты. * Штаммы, использованные для конструирования циано-бактериальных консорциумов.

агаре (МПА) и в некоторых случаях — по стандарту мутности с помощью колориметра КФК-3 (ОАО "Загорский оптико-механический завод", Россия).

Проверку способности культур к росту в присутствии ароматических углеводородов проводили на агаризованной синтетической среде Е-8. Пробы углеводородов (нефть, дизельное топливо, толуол), используемых в качестве единственных источников углерода, наливали в крышки перевернутых чашек Петри, и они поступали к клеткам в виде паров.

Изучение роста культур на жидкой среде Е-8 с углеводородами в условиях аэрации проводили в

590

Рис. 1. Альгологически и бактериологически чистые культуры цианобактерий Phormidium sp. К-1. а — культура цианобактерий Phormidium sp. К-1; б — альгологически чистая культура цианобактерий Phormidium sp. К-1; в — альгологически чистая культура цианобактерий Phormidium sp. К-1 без слизи; г — бактериологически чистая (аксеничная) культура цианобактерий Phormidium sp. К-1.

колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл среды. Цианобактерии вносили в количестве 200 тыс кл./мл, бактерии - в количестве 1 млн кл./мл и инкубировали их при освещении 1 клк с суточной периодичностью (свет-темнота). Скорость роста культур в среде контролировали нефелометриче-ски с помощью фотометра КВК-2МП (ОАО "Загорский оптико-механический завод") в стандартных кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 540 нм. Пробы (по 2 мл) отбирали каждые сутки.

Изучение деструктивной активности консорциумов проводили на среде Е-8. Продукты окисления нефти и нефтепродуктов определяли методом ИК-спектроскопии на приборе Satellite FTIR ("Mattson", США). 10 мл суспензии переносили в пробирку объемом 20 мл, добавляли 2 г MgSO4 • • 7 H2O и приливали 10 мл CCl4. После 5-минутной выдержки экстракт отделяли. Для спектро-

эА и др.

фотометрирования экстрактов использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Спектры регистрировали в области 3000— 2800/см.

Экпериментальную очистку грунта, загрязненного мазутом, в полевых условиях проводили на территории полигона-накопителя по приему производственных отходов полей испарения ТОО "Химпромсервис—Актобе", на территории месторождения "Жанажол", которое находится в восточной прибрежной зоне Прикаспийской впадины в пределах Предуральского плато, расположенного между Мугалжарскими горами и долиной р. Эмба. Для получения биопрепарата 100 мл суспензии цианобактерии Phormidium sp. с титром 1 млн кл./мл, полученной на жидкой среде Заррука, тщательно разбивали на горизонтальном шейкере и вносили в пластиковый контейнер емкостью 1 л, в который помещали стерильную полужидкую (с 0.5% агара) среду Заррука объемом 600 мл [10]. После инкубации в течение 1 месяца получали цианоба

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком