ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 11, с. 1273-1285
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 631.461.5:575
КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ СИМБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ: ЭВОЛЮЦИОННЫЕ МОДЕЛИ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
© 2014 г. Н. А. Проворов1, 4, О. П. Онищук1, С. Н. Юргель2, О. Н. Курчак1, Е. П. Чижевская1,
Н. И. Воробьев1, Т. В. Затовская3, Б. В. Симаров1
1Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии,
Санкт-Петербург 196608 e-mail:provorov@newmail. ru 2Институт биологической химии, Университет Вашингтона, Пульман, WA, 99164-6340, США 3Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного Национальной академии наук Украины,
Киев Д03680, Украина
4Международный научный центр "Биотехнологии третьего тысячелетия", Университет ИТМО,
Санкт-Петербург 191002 Поступила в редакцию 28.03.2014 г.
На примере ^-фиксирующего бобово-ризобиального симбиоза показано, что возникновение и эволюция бактерий — симбионтов растений определяется: 1) формированием новых систем sym-ге-нов, основанным на реорганизациях собственных геномов бактерий, а также на переносе генов от неродственных организмов; 2) утратой генов, которые кодируют функции автономного существования и являются антагонистами симбиотических функций (негативные регуляторы симбиоза). Поэтому конструирование высокоэффективных штаммов ризобий должно включать как повышение активности sym-генов (например, nif-, fix- и dct-генов, контролирующих синтез нитрогеназы или ее снабжение энергией), так и инактивацию выявленных нами негативных регуляторов симбиоза (ef-генов, контролирующих транспорт углеводов, продукцию полисахаридов и запасных питательных веществ, а также окислительно-восстановительные процессы).
DOI: 10.7868/S0016675814110113
Взаимодействия с бактериями обеспечивают растениям выполнение ряда важнейших адаптивных функций, включая минеральное питание (^-фиксация, ассимиляция нерастворимых фосфатов), защиту от патогенов и фитофагов (инактивация организмов-антагонистов в результате прямого на них воздействия либо индукции иммунных систем хозяев), а также устойчивость к различным абиотическим стрессам [1, 2].
Изучение ^-фиксирующих микроорганизмов, в первую очередь внутриклеточных симбионтов бобовых (клубеньковые бактерии или ризобии), позволило выявить молекулярные механизмы формирования систем симбиотических (¡ут) генов, включая перестройки собственных генов бактерий (например, путем их дупликации-дивергенции), а также перенос генов от неродственных организмов [3]. Выяснение этих механизмов открывает широкие возможности для конструирования ценных для практики микросимбионтов, использование которых для инокуляции культурных растений позволяет резко снизить количества вносимых в почву химических удобрений и пестицидов [2]. В нашей статье будет рассмотрена возможность "переноса знаний" об
эволюции симбиотических бактерий в сферы генетической инженерии и биотехнологии микроб-но-растительных симбиозов, используемых для формирования стабильных экосистем и высокопродуктивных агроценозов.
ЭВОЛЮЦИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ СИМБИОЗОВ
Наиболее разработанной моделью симбиоло-гии является ^-фиксирующий бобово-ризоби-альный симбиоз (БРС), изучение которого позволило вскрыть базовые механизмы коэволюции, действующие на морфофизиологическом, молекулярном и экологическом уровнях организации надвидовых систем [4]. Применение широкого спектра методов экспериментального и математического моделирования выявило связь микроэволюционных процессов, определяемых отбором на повышение адаптивного потенциала клубеньковых бактерий и бобовых растений, с макроэво-люционными преобразованиями симбиосисте-мы, приводящими к возрастанию уровня организации ^-фиксирующих клубеньков [3].
Анализ эволюционной динамики БРС показал, что коэволюция тесно взаимодействующих,
Таблица 1. Основные стадии эволюции ризобий, связанной с повышением генетической специализации к симбиозу [7]
Зависимость Фиксация: Синтез Моё-факторов Хромосомы, Плазмиды
ризобий от хозяев* CO2 N2 (симбиотическая специфичность) тпн
Факультативная: Bradyrhizobium spp. (BTAi1, ORS278) + + Отсутствует (узкая: симбиоз с Aeschynomene) 7500—8400 100-200 тпн или отсутствуют; в симбиозе не участвуют
Экологически облигатная: B. japonicum - + Выявлен (широкая: симбиоз с представителями разных триб или подсемейств бобовых) 9100
Экологически облигатная: Mesorhizobium spp. — — 7000 200-400 тпн; иногда участвуют в симбиозе
Экологически облигатная: Rhizobium leguminosarum, R. galegae, Sinorhizobium meliloti, S. medicae Выявлен (узкая: симбиоз с группами перекрестной инокуляции, ограниченными определенной трибой или родом бобовых) 3300—4700 300-1900 тпн; всегда участвуют в симбиозе (несут основные sym-ге-ны**)
* У факультативных симбионтов отсутствуют специализированные генные системы симбиоза (он формируется за счет тех же генов, что и освоение внешней среды), тогда как у экологически облигатных симбионтов взаимодействия с хозяевами контролируются обширными системами генов, не функционирующих вне симбиоза.
** Гены синтеза нитрогеназы (nif), регуляции ее активности (fix, dct) и синтеза сигнальных липо-хито-олигосахаридных Nod-факторов (nod).
генетически интегрированных партнеров симбиоза существенно отличается по своим механизмам от "дарвиновской" эволюции свободножи-вущих, генетически изолированных организмов [5, 6]. Действительно, повышение ^-фиксирующей активности микросимбионтов бобовых, происходящее при трансформациях ризосферных и эндофитных бактерий в клубенькообразующие формы, определяется групповым (междемовым, родственным) отбором, который индуцируется в популяциях микроорганизмов, занимающих субклеточные компартменты клубеньков, и вызывает закрепление у них полезных для хозяев ("альтруистических") признаков [7]. В ряде симбиозов, образуемых бактериями и растениями, хозяева способны длительно сохранять симбио-тические адаптации на основе регулярной передачи (вертикальной — через семена либо псевдовертикальной — через внешнюю среду) симбионтов в ряду поколений [8].
У многих бобовых образование субклеточных компартментов, содержащих ризобии, сочетается с развитием клубеньков недетерминированного типа, при котором высокая симбиотическая эффективность сопряжена с необратимой диффе-ренцировкой ризобий в неспособные к размножению бактероиды. Их разрушение в базальной части (зоне старения) клубенька может рассмат-
риваться в качестве "экологической платы" за ускоренное размножение недифференцированных бактерий, изогенных бактероидам, в инфекционных нитях, межклеточных пространствах, а иногда и в ризосфере, которое происходит благодаря активному снабжению ^-фиксирующих клубеньков продуктами фотосинтеза [3].
Изучение БРС показало, что ризобии в ходе своей эволюции прошли несколько этапов, на которых происходило возрастание зависимости микросимбионтов от хозяев (табл. 1). Оно было сопряжено с эволюцией микробного генома от унитарного типа (подавляющее большинство генов сосредоточено в хромосоме [9]) к многокомпонентному типу, при котором геном разделен на несколько крупных репликонов. У ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) sym-гены, контролирующие ключевые стадии развития клубеньков (nod-гены — синтез сигнальных Nod-факторов, nf-гены — биосинтез нитрогеназы, fix- и dct-гены — обеспечение условий ее функционирования, например снабжение электронами и энергией), находятся на мегаплазмидах, размеры которых составляют 1100-1900 тпн [10].
Важно отметить, что достигаемое в ходе этой эволюции повышение эффективности симбиоза, основанное на приобретении бактериями генных систем для взаимодействия с растениями, сочета-
ется с утратой ряда метаболических и регулятор-ных генов, важных для выживания бактерий в почве, но функционально альтернативных развитию симбиоза. Поэтому в результате эволюции, происходившей по сценарию "приобретения и утраты генов", ризобии переходили от факультативного (необязательного) взаимодействия с растениями к адаптивно более значимому, экологически облигатному (необходимому для освоения новых экологических ниш) взаимодействию, сопряженному с формированием обширных систем sym-генов (табл. 1). Утраченные в ходе этой эволюции признаки ризобий включают:
1) фототрофность, которая выявлена у анце-стральных штаммов Bradyrhizobium spp. (BTAil, ORS278), а у эволюционно продвинутых штаммов B. japonicum замещена синтезом Nod-факто-ров, обеспечивающим регулярное образование клубеньков (отказ бактерий от самостоятельной фиксации СО2 компенсируется доступом к продуктам растительного фотосинтеза);
2) способность фиксировать N2 ex planta (переход к симбиотической фиксации N2 был основан на глубоких реорганизациях системы синтеза нит-рогеназы, включая утрату ряда nf-генов, имевшихся у свободноживущих предков ризобий [11]).
Реализация этого эволюционного сценария была связана как с преобразованиями собственного генома ^-фиксирующих бактерий, так и с переносом в них генов от других организмов. Одним из его результатов могло быть приобретение ризобиями гена nodA, который кодирует ключевую стадию биосинтеза сигнального Nod-факто-ра — присоединение ацильного остатка к олиго-хитиновой цепи [12]. Этот ген отсутствует у родственных ризобиям а-протеобактерий, однако может иметь гомологи у грибов арбускулярной микоризы, которые, как и ризобии, инокулируют растения с помощью сигналов олиго-хитиновой природы [13].
АКТИВАЦИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ
Удобной моделью для развития методологии конструирования симбиотически эффективных бактерий являются штаммы ризобий с модификациями системы йе?-генов, контролирующих транспорт дикарбоновых кислот (ДК) — сукцина-та и малата — энергетических субстратов, используемых ^-фиксирующими бактероидами. О важной роли этих генов в определении эффективности симбиоза (ЭС) — продуктивности партнеров, достигаемой при взаимодействии, свидетельствует утрата ^-фиксирующей активности при мутациях по структурному гену дикарбокси-латпермеазы DctA (йеЛ), тогда как инактивация
%
100 г 80 -
60 -
40 -
20 -
0
Рис. 1. Влияние генетических модификаций ризобий на показатели симбиотическо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.