НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 1, с. 26-29
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.25
КООРДИНИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ ПРО- И АНТИАПОПТОЗНЫХ БЕЛКОВ В ГИППОКАМПЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫС
© 2011 г. П. Н. Меньшанов1, *, В. В. Музыка1,2, Н. Н. Дыгало1,2
Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск 2Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный университет, Новосибирск
Уровни белков апоптоза Ве1-ХЬ, Вах, интактной и активной форм каспазы-3 определяли методом иммуноблота в гиппокампе и стволе головного мозга трехдневных крысят. Экспрессия про- и ан-тиапоптозных белков в отделах формирующегося мозга демонстрирует индивидуальную изменчивость (коэффициенты вариации 10—40%). Оцененные на основе этой изменчивости взаимосвязи между уровнями экспрессии этих белков в стволе головного мозга — структуре с низким уровнем апоптоза в этот период онтогенеза не достигали значимого уровня. В то же время в гиппокампе экспрессия проапоптозных белков Вах и активной формы каспазы-3 достоверно положительно коррелировали между собой (г = +0.653). Уровни этих двух белков проявляли значительную отрицательную взаимосвязь с содержанием антиапоптозного белка Ве1-ХЬ (г = —0.651 и —0.740 соответственно). Результаты свидетельствуют о координированной экспрессии белков апоптозного каскада в гиппокампе — структуре мозга с высокой интенсивностью элиминации избыточных клеток в раннем постнатальном онтогенезе.
Ключевые слова: неонатальноеразвитие мозга, гиппокамп, ствол мозга, программирумая клеточная гибель, Бе1-ХЬ, Бах, каспаза-3.
ВВЕДЕНИЕ
Программируемая гибель клеток является непременным участником формирования центральной нервной системы в онтогенезе млекопитающих [1]. Предрасположенность клеток к гибели определяется соотношением экспрессии в них про- и ан-тиапоптозных белков, которые могут нейтрализовать действие друг друга, как правило, путем белок-белкового взаимодействия [2]. Сам способ функционирования этих белков позволяет предполагать взаимосвязь их экспрессии, а также наличие особенностей подобной взаимосвязи в отделах формирующегося мозга, различающихся по интенсивности в них физиологического апоптоза. В перинатальный период развития интенсивность апоптоза существенно ниже в каудальных (стволовых) отделах мозга крыс по сравнению с его ростральными отделами, такими, как, например, кора или гиппокамп [2—9]. Несмотря на относительно высокий в неонатальный период по сравнению с мозгом взрослых животных уровень апоптоза, анализ взаимосвязи экспрессии его белков между собой тем не менее затруднен невысокой частотой этого процесса. Лишь небольшое количество клеток одновременно находится в процессе программируемой ги-
* Адресат для корреспонденции: 630090 Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, д.10; тел.: +7-(383)-363-49-58-3311; факс: +7-(383)-333-12-78; e-mail: eternity@bionet.nsc.ru, dxkorall@gmail.com.
бели в отделах развивающегося головного мозга [5]. По-видимому, в связи с этим сведения по данному вопросу в литературе отсутствуют. Вместе с тем такие данные могут оказаться полезными для оценки вклада отдельных белков-компонентов апоптозно-го каскада в его функционирование в целом, а также возможной совместной регуляции их экспрессии. Для получения таких сведений может быть использована естественная индивидуальная изменчивость по экспрессии белков. Поэтому в данной работе у неонатальных крысят определили уровни регуля-торных белков программируемой гибели клеток: проапоптознго белка Вах и антиапоптозного белка Ве1-ХЬ, а также ключевой исполнительной проте-азы этого процесса каспазы-3, в стволе головного мозга, характеризующемся в этот период онтогенеза невысокой интенсивностью физиологической гибели клеток, и в гиппокампе, в котором этот процесс идет заметно активнее, чем в стволе [2], и на основе естественной индивидуальной изменчивости, наблюдаемой по содержанию этих белков, оценивали взаимное сопряжение их экспрессии.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использовали трехдневных крысят (п = 21), рожденных и вскармливаемых собственными матерями — самками линии Вистар. Условия содержания и использования крыс в опытах соот-
КООРДИНИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ ПРО- И АНТИАПОПТОЗНЫХ БЕЛКОВ
27
ветствовали отечественным и международным нормам гуманного обращения с экспериментальными животными.
Экспрессию белков апоптоза — Bax, Bcl-XL, прокаспазы-3 и активной каспазы-3 определяли в гиппокампе и стволовой части мозга, включавшей мост и продолговатый мозг. Для определения содержания белков образцы ткани гомогенизировали в лизирующем буфере (150 mM NaCl, 50 mM трис-HCl (pH 7.4), 1% тритона X-100, 1 mM PMSF и по 1 мкг/мл леупептина, пепстатина и апротинина). После центрифугирования (14000 g, 4°С, 15 мин) 50 мкг белка супернатанта денатурировали в буфере (50 mM трис-HCl, pH 6.8, 10% глицерина, 100 mM
2-р-меркаптоэтанола, 1% додецилсульфата натрия, 0.002% бромфенолового синего; 5 мин при 95°С), разделяли электрофорезом (система Mini-PROTEAN 3 Dodeca, Bio-Rad Laboratories, США) в 16.5% по-лиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и переносили на 0.45 мм нитроцеллюлозную мембрану (система Trans-Blot, Bio-Rad Laboratories, США).
Белки выявляли на мембране поликлональными кроличьими антителами (Santa Cruz Biotechnology, США): первичными к Bax (P-19, 1 : 250), Bcl-XL (S-18, 1 : 250), прокаспазе-3 и активной каспазе-3 (H-277, 1 : 250), и бета-актину (I-19-R, 1 : 1000), а также вторичными, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Сигнал проявляли 5-бром-4-хлор-
3-индолил фосфатом (BCIP) и нитротетразолием голубым (NBT). Интенсивность окрашивания полос, соответствующих анализируемым белкам, определяли путем сканирования мембран (Chemi-doc, Bio-Rad Laboratories, США) и компьютерной денситометрии (программа Scion Image 4.0.3.2 Scion Corporation, США). Условия проведения анализов обеспечивали линейную зависимость интенсивности сигналов отдельного белка от массы общего белка, нанесенного на дорожку гель-электрофореза, что является необходимым условием возможности оценки количества каждого анализируемого белка. Различия образцов по абсолютным значениям сигналов денситометрии могут быть обусловлены как влиянием биологических факторов, так и техническими вариациями нанесения общего количества белка на дорожки электрофореза, поэтому необходимо нормирование сигналов или их выравнивание относительно белка, содержание которого одинаково в исследуемых тканях. В связи с этим уровни белков апоптоза оценивали относительно содержания в образце актина. Вариабельность образцов по массе в них общего белка способна существенно повлиять и на результаты анализа сопряжения экспрессии отдельных белков апоптоза между собой, поэтому этот анализ также проводили при выравнивании значений денситометрии индивидуальных образцов по уровню в них актина.
Межрегиональные различия по экспрессии белков в отделах мозга оценивали однофакторным
дисперсионным анализом, достоверность различий между группами устанавливали по критерию множественных сравнений Фишера. Взаимосвязь экспрессии белков апоптоза между собой оценивали, используя частный парный коэффициент линейной корреляции Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Новорожденные крысята, несмотря на свой одинаковый 3-дневный возраст и стандартные условия содержания, имели заметные индивидуальные особенности. Они различались, например, по массе тела, варьировавшей в данном эксперименте от 6.36 до 8.02 г, что может быть связано, в частности, с неодинаковым материнским уходом, оказываемым самками своим потомкам. Эта индивидуальная изменчивость не препятствует, однако, выявлению отчетливых межрегиональных закономерностей экспрессии белков апоптоза в формирующемся головном мозге.
Одна из таких закономерностей — различие гип-покампа и ствола мозга по степени активации ключевой эффекторной протеазы апоптоза каспазы-3 — важного маркера интенсивности протекания программируемой клеточной гибели в неонатальном мозге [2, 8]. Наблюдаемый в наших опытах более высокий в гиппокампе по сравнению со стволом мозга уровень активной каспазы-3 (рисунок; Р(1,19) = 16.20, р = 0.00072) согласуется с данными литературы о более интенсивном апоптозе в ростральных нежели в каудальных отделах мозга нео-натальных грызунов [2]. Об этом же свидетельствует и сниженный в гиппокампе по сравнению со стволом уровень антиапоптозного белка Ве1-ХЬ (рисунок; Б(1, 19) = 43.52, р = 0.00001) при сопоставимой в обоих этих отделах экспрессии проапоптозного белка Вах (рисунок; Б(1, 19) = 0.45, р = 0.508).
Сами по себе сведения об уровнях белков апо-птоза в ткани, обсуждавшиеся выше, не позволяют судить о наличии или отсутствии сопряжения их экспрессии. Для выявления возможности такой взаимосвязи может быть полезной индивидуальная изменчивость животных по экспрессии белков апоптоза. Кроме различий в физическом развитии крысят в наших экспериментах наблюдались и заметные индивидуальные особенности по экспрессии белков апоптозного каскада в их мозге. Коэффициенты вариации экспрессии отдельных белков в исследованных отделах мозга находились в диапазоне 10—40% в стволе и 10—28% в гиппокампе, что позволяет использовать эту индивидуальную изменчивость для оценки характера возможного сопряжения экспрессии белков апоптоза между собой.
Однако корреляционный анализ, проведенный между уровнями белков апоптоза в образцах ткани ствола мозга, полученных от индивидуальных животных, не выявил каких-либо существенных взаи-
28
МЕНЬШАНОВ и др.
Ствол
Гиппокамп
Bcl-XL
Bax
Прокаспаза-3 Активная каспаза-3
Актин
1.00
- 28 кДа
- 21 кДа
- 32 кДа
- 17 кДа
- 42 кДа
Ствол мозга
Bcl-XL Bax
инт. акт. каспаза-3
Экспрессия белков апоптоза - Bcl-XL, Bax, неактивной и активной форм каспазы-3 в стволе мозга и гиппокампе трехдневных крысят. (а) Иммунодетекция белков после разделения гель-электрофорезом. (б) Уровни белков. *p < 0.001 по сравнению со стволом мозга.
мосвязей между экспрессией про- и антиапоптоз-ных молекул (таблица). Активность классического пути программируемой гибели клеток, в реализацию которого вов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.