БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 12, с. 1715 - 1723
УДК 577.218
КОРОТКИЕ ОТКРЫТЫЕ РАМКИ СЧИТЫВАНИЯ РЕГУЛИРУЮТ ТРАНСЛЯЦИЮ ДЛИННОЙ
ИЗОФОРМЫ мРНК ГЕНА ЗЬЛИП, КОДИРУЮЩЕГО КОСТИМУЛЯТОРНЫЙ РЕЦЕПТОР CD150
© 2014 Л.В. Путляева1, А.М. Шварц1, К.В. Корнеев12, М. Чович1, Л.А. Урошлев13, В.Ю. Макеев13, С.Е. Дмитриев14, Д.В. Купраш12*
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32; факс: +7(499)135-1405, электронная почта: kuprash@gmail.com 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва 3 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991 Москва
4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
Поступила в редакцию 30.06.14
Более 40% генов человека содержат в 5'-нетранслируемых областях (5'-НТО) короткие открытые рамки считывания (кОРС), уменьшающие эффективность трансляции основного белка, и кроме того экспрессируют хотя бы одну укороченную изоформу мРНК, не содержащую кОРС. Мы исследовали регуляцию трансляции мРНК гена БЬАЫЕ1. Данный ген кодирует мембранный белок СБ150 — член СБ2 суперсемейства, кос-тимуляторный рецептор лимфоцитов, рецептор вируса кори и микробный сенсор макрофагов. Транскрипты гена БЬАЫЕ1 представлены как минимум двумя изоформами, отличающимися длиной 5'-НТО. В длинной изоформе мРНК БЬАЫЕ1, содержащей в 5'-НТО четыре кОРС, стоп-кодон кОРС4 перекрывается с АИв-кодоном основной рамки, образуя потенциальный сайт терминации-реинициации ИвАИв, а между стартами кОРС2 и кОРСЗ находится последовательность, идентичная т.н. «мотиву 1» из последовательности ТИЯВ8. Эта последовательность присутствует в полицистронных РНК некоторых вирусов и необходима для реализации механизма сопряженной терминации-реинициации при их трансляции. В модельной клеточной системе репортерная мРНК на основе 5'-НТО короткой изоформы мРНК БЬАЫЕ1, не содержащей кОРС, транслируется в 5—6 раз эффективнее, чем мРНК с 5'-НТО длинной изоформы. Нуклеотидные замены, разрушающие старт-кодоны кОРС2-4, существенно повышают эффективность трансляции репортер-ной РНК, в то время как замена двух нуклеотидов в составе «мотива 1» ТИЯВ8 снижает ее вдвое. Эти данные позволяют предположить, что ТИЯВ8-подобные элементы могут быть задействованы в регуляции трансляции некоторых клеточных мРНК, содержащих кОРС.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биосинтез белка, регуляция трансляции, кОРС, мРНК.
Регуляция экспрессии генов на посттранскрипционном уровне является одним из ключевых механизмов, благодаря которому клетки могут изменять профиль экспрессии генов в ответ на внутренние или внешние раздражители [1]. В регуляцию процесса трансляции вовлечено большое количество разнообразных факторов, действующих на стадиях инициации, элонгации, терминации трансляции и даже после ее окончания. Регуляция на стадии инициации мо-
* Адресат для корреспонденции.
жет, в частности, осуществляться с помощью различных цис-элементов, присутствующих в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК. Одними из таких элементов служат короткие открытые рамки считывания (кОРС), в англоязычной литературе обычно называемые «upstream open reading frames» (uORF) — последовательности, ограниченные стартовым и терминирующим кодонами, находящимися в одной рамке, расположенные в 5'-НТО проксимальнее основной ОРС [2]. Такая ситуация является весьма распространенной: примерно в половине мРНК
1715
человека обнаруживается одна или несколько кОРС, находящихся перед основной ОРС [3, 4]. В некоторых случаях полипептид, синтезируемый с кОРС, оказывается функциональным [5], но, как правило, наличие таких кОРС в 5'-НТО служит для регуляции экспрессии белка, закодированного в основной рамке [2, 6]. В большинстве случаев это является простым и эффективным способом снижения уровня экспрессии основного белка [7], поскольку, в соответствии со сканирующей моделью [8], наличие альтернативных стартовых кодонов в лидерной последовательности приводит к снижению числа рибосом на старт-кодоне основной ОРС. Степень подавления напрямую зависит от контекста старт-кодона кОРС: чем эффективнее происходит его узнавание, тем хуже транслируется основная ОРС [9, 10]. Однако наличие одной или нескольких кОРС в мРНК может придавать ее трансляции устойчивость к недостатку некоторых факторов инициации — тогда это, наоборот, приводит к повышению эффективности синтеза основного продукта в определенных условиях [6, 11]. Так, система кОРС в лидерах мРНК некоторых генов стрессового ответа позволяет этим транскриптам вести активную трансляцию в условиях инактивации фактора eIF2 [12, 13]. Теоретически, от любой мРНК, содержащей несколько кОРС в 5'-НТО, можно ожидать необычной зависимости от доступности eIF2 [12]. Наличие кОРС может также придавать мРНК способность к переключению синтеза между двумя изоформами белка в зависимости от концентраций активного eIF2 и eIF4E [14].
Трансляция мРНК, в 5'-НТО которой находятся кОРС, задействует целый ряд механизмов, из которых в нашем случае наиболее интересен механизм сопряженной терминации-реинициа-ции с участием регуляторного элемента TURBS (Termination/Translation Upstream Ribosome Binding Site). Этот механизм описан для геномов некоторых вирусов — например, калицивирусов [15, 16] и вируса гриппа B [17]. Предполагается, что участок TURBS с коровой последовательностью UGGGA взаимодействует с комплементарным участком 26-й петли 18S РНК и/или с фактором eIF3, что приводит к задержке рибосомы около стоп-кодона с последующей реини-циацией на старт-кодоне, пересекающемся со стоп-кодоном или даже расположенном перед ним [16, 18, 19].
CD150, кодируемый геном SLAMF1, — трансмембранный гликопротеин массой 70 кДа, который у человека и мыши экспрессируется на поверхности В- и Т-лимфоцитов (на различных стадиях дифференцировки), зрелых дендритных клеток, тромбоцитов, моноцитов и макрофагов
[20]. Экспрессия БЬЛМ¥1 повышается при активации лимфоцитов и моноцитов [21]. В Т-лим-фоцитах СБ150 стимулирует антиген-специфичную, СБ28-независимую пролиферацию и индуцирует синтез №N7 [22], тогда как в В-лим-фоцитах он индуцирует (или усиливает) пролиферацию и синтез иммуноглобулинов [23]. СБ150 также может служить рецептором для вируса кори [24], участвовать в процессе распознавания грамотрицательных бактерий и в последующей активации макрофагов [25]. Показано, что нарушение регуляции экспрессии Б1ЛМ¥1 может приводить к развитию аутоиммунных заболеваний и иммунодефицитных состояний [26]. При исследовании некоторых В-клеточных лимфом было также показано повышение экспрессии СБ 150 и участие этого рецептора в активации митоген-активированных протеинкиназ [27, 28].
Для гена Б1ЛМ¥1 аннотировано несколько изоформ мРНК, различающихся по длине 5'-НТО. Мы заметили, что 5'-НТО длинной изоформы содержит четыре кОРС, и предположили, что они могут играть роль в регуляции экспрессии гена. Также любопытно, что стоп-кодон последней кОРС перекрывается со старт-кодоном основной рамки (UGAUG), а в 5'-НТО длинной изоформы находится характерная для ТиЯВ8 коровая последовательность UGGGA, что позволяет предположить действие механизма сопряженной терминации-реинициации [15, 17]. Мы проанализировали возможные механизмы регуляции трансляции длинной изоформы мРНК Б1ЛМ¥1 в модельной системе, используя точечный мутагенез и селективное ингибирова-ние факторов транскрипции.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Плазмидные конструкции. Генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным методикам; использовали ферменты производства «Fermentas»/«ThermoScientific» (Литва) и «Сибэн-зим» (Россия). Для создания базовой конструкции «long» последовательность 5'-НТО длинной изоформы мРНК SLAMF1 (с 5'-концом, соответствующим мРНК BC012602) была амплифици-рована вместе с первыми 10 триплетами кодирующей последовательности гена и клонирована по сайтам Hindlll и Narl в вектор pGL3-control («Promega», США) в одной ОРС с геном люци-феразы светлячка (Firefly luciferase, Fluc), собственный старт-кодон которого был удален. Поскольку амплифицируемый фрагмент содержал сайт узнавания эндонуклеазы Hindlll, к последовательности прямого праймера был добавлен сайт узнавания эндонуклеазы llS типа Bsal в
нуклеотидном контексте, который после расщепления приводил к появлению HindIII-сов-местимого «липкого» конца. На базе конструкции «long» были созданы мутантные варианты «mut AUG2/3», «mut AUG3/4» и «mut AUG4» с заменой старт-кодонов AUG в соответствующих кОРС либо на лейциновый триплет UUG, либо на стоп-кодон UAG. Конструкция «mut UGGGA» содержала замену двух нуклеотидов коровой последовательности участка TURBS на UGACA. Мутагенез проводили с помощью двухступенчатой ПЦР, последовательность полученных конструкций проверяли секвенирова-нием. Последовательность олигонуклеотидных праймеров представлена в таблице.
m7G-кэпированные и полиаденилированные РНК получали и очищали согласно [29]. В качестве матрицы использовали ПЦР-продукты, полученные с соответствующих плазмид. ПЦР-про-дукты «long», «mut AUG2/3», «mut AUG3/4», «mut AUG4» и «mut UGGGA» были получены с использованием прямого праймера T7CDfor. Более короткие ПЦР-продукты «del AUG1» (уко-
роченный до начала кОРС 1) и «short» (с 5'-кон-цом, соответствующим мРНК AK304237) были получены с использованием прямых праймеров T7CD12 и T7CDsh соответственно. Все прямые праймеры содержали последовательность промотора Т7 РНК-полимеразы. Обратный прай-мер FLA50, использованный для получения всех ПЦР-продуктов, соответствовал дистальному участку Fluc и содержал поли(Т)-участок. Транскрипцию РНК in vitro проводили с использованием набора «T7 RiboMAX Large Scale RNA Production kit» («Promega», США). Для приготовления т7С-кэпированных транскриптов аналог m7G кэпа 3'-O-Me-m7GpppG («New England Biolabs», США) добавляли к транскрипционной смеси в соотношении 5 : 1 к GTP. Полученные таким образом РНК очищали осаждением с хлоридом лития и проверяли на целостность в денатурирующем ПААГ.
Клеточная культура и процедура трансфекции. Клетки HEK293T культивировали в питательной среде DMEM
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.