ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 20ll, том 437, № l, с. l24-l27
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК S77.l
КОРОТКИЕ ПЕПТИДЫ МОДУЛИРУЮТ ДЕЙСТВИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ
ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
© 2011 г. В. Х. Хавинсон, Л. И. Федореева, член-корреспондент РАН Б. Ф. Ванюшин
Поступило 07.09.2010 г.
Короткие пептиды (2,3,4-аминокислоты) инги-бируют или увеличивают гидролиз ДНК ^-фага сайт-специфическими пшеничными эндонукле-азами ^^N1 и ^^N2 в зависимости от статуса метилирования ДНК. Модуляция пептидами действия эндонуклеаз, надо полагать, происходит в результате их связывания с ДНК. Пептиды распознают не только определенные последовательности в ДНК, но и статус их метилирования. Пептиды связываются как с ДНК, так и с одно- и двутяжевыми дезоксирибоолигонуклеотидами, содержащими метилируемые у эукариот СNG- и СО-сайты. При гидролизе эндонуклеазами дву-тяжевых структур пептиды влияют на набор гид-ролизуемых сайтов. Действие пептидов (бронхо-ген, эпиталон, пинеалон и др.) на гидролиз ДНК эндонуклеазами различно, и оно модулируется гистонами (гистон Н1). Сайт-специфические взаимодействия пептидов с ДНК могут эпигенетически контролировать генетические функции клетки.
В основе физиологического действия изученных нами пептидов лежит их ткане- или геноспецифич-ное взаимодействие с ДНК [1]. Однако закономерности и механизмы такого избирательного связывания пептидов с ДНК и обусловленные этим изменения в транскрипции все еще мало изучены. От такого связывания пептидов с ДНК должно зависеть действие многих конкурирующих за те же места связывания белков (ферментов), оперирующих с ДНК, в том числе и эндонуклеаз.
Мы изучили действие коротких пептидов на гидролиз ДНК фага X и олигонуклеотидов, осу-
Санкт-Петербургский институт
биорегуляции и геронтологии
Российской Академии медицинских наук
Всероссийский научно-исследовательский институт
сельскохозяйственной биотехнологии
Российской академии сельскохозяйственных наук,
Москва
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва
ществляемый эндонуклеазами пшеницы, и исследовали как на этот процесс может влиять ги-стон Н1. Исследовали изменения флуоресценции меченых олигонуклеотидов под влиянием пептидов. Использованы пептиды: эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), пинеалон (Glu-Asp-Arg), бронхоген (Ala-Asp-Glu-Leu), тестаген (Lys-Glu-Asp-Gly), кардиоген (Ala-Glu-Asp-Arg), панкраген (Lys-Glu-Asp-Trp) [2]. Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 выделяли из колеоптилей пшеницы [3], как описано ранее [4, 5]. WEN1 предпочтительно гидролизует по CNG-сайтам метилированную ДНК (dcm+, dam+) фага X [4], содержащую остатки 5-метилцитозина в последовательностях Cm5CWGG и остатки ^-ме-тиладенина в Gm6ATC-сайтах. WEN2 гидролизует неметилированную ДНК (dcm-, dam-) [5]. ДНК гидролизовали ферментами WEN1 и WEN2 в разработанных нами стандартных и идентичных условиях без добавления [4, 5] либо с добавлением в реакционную смесь пептидов (1, 2 мкг на 1 мкг ДНК). Продукты гидролиза ДНК и олигонук-леотидов разделяли электрофорезом соответственно в 1.5%-ной агарозе и 20%-ном полиакри-ламидном геле. Спектры флуоресценции олиго-нуклеотидов снимали на спектрофлуориметре Perkin-Elmer LS55 (США).
Эпиталон подавляет гидролиз неметилирован-ной ДНК ферментом WEN2 (рис. 1а, 5); в присутствии гистона Н1 это ингибирующее действие пептида менее выражено (дорожка б). По-видимому, гистон Н1 снижает ингибирующее действие эпита-лона, делая некоторые сайты ДНК более доступными для гидролиза ферментом. В присутствии брон-хогена ДНК избирательно гидролизуется до фрагментов длиной около 140 нуклеотидов. По-видимому, бронхоген связывается с иными (чем эпиталон) сайтами ДНК, защищая их от гидролиза. Под влиянием гистона Н1 это защитное действие бронхогена снимается (дорожка 8) и ДНК гидролизуется полностью, как в контроле. Пине-алон практически не влияет на гидролиз немети-лированной ДНК ферментом WEN2 (дорожка 9), однако с гистоном Н1 он сильно ингибирует гидролиз этой ДНК (дорожка l0). Сам по себе гистон Н1 не влиял на гидролиз ДНК (дорожка 4). Следовательно, различные пептиды модулируют дей-
КОРОТКИЕ ПЕПТИДЫ МОДУЛИРУЮТ действие эндонуклеаз
125
(а)
2
1
8 9
(б)
2
11 12 13 14 15 16 17 18 19
1
9
12 13
15 16 17 18 19
Рис. 1. Электрофоретическое разделение (в 1.5%-ной агарозе) продуктов гидролиза неметилированной (а) и метилированной (б) Х-фаговой ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2. 1 — неметилированная фаговая ДНК; 2 — 1 + фермент WEN2; 3 — 2 + Mg2+; 4 — 2 + гистон Н1; 5 — 2 + эпиталон; 6 —4 + эпиталон; 7 — 2 + бронхоген; 8 — 4 + брон-хоген; 9 — 2 + пинеалон; 10 — 4 + пинеалон; 11 — 1 + фермент WEN1; 12 — 11 + Mg2+; 13 — 11 + гистон Н1; 14 — 11 + эпиталон; 15 — 13 + эпиталон; 16 — 11 + бронхоген; 17 — 13 + бронхоген; 18 — 11 + пинеалон; 19 — 13 + пинеалон.
ствие эндонуклеазы по-разному и их действие может быть опосредовано гистонами. Это — очень важный факт, поскольку в клетке пептиды изначально должны найти в хроматине те места, которые доступны для связывания с ДНК, а эта доступность может определяться гистонами.
Эпиталон практически не влиял на гидролиз метилированной ДНК ферментом WEN2 (рис. 1б, 5), но полностью подавлял гидролиз неметилированной ДНК (рис. 1а, 5). Это означает, что пептид "распознает" метилированную и неметилирован-
ную ДНК и, по-видимому, по-разному с ними взаимодействует. Бронхоген сильно активирует гидролиз метилированной ДНК ферментом WEN2 (рис. 1б, 7). Значит, действие эпиталона и бронхогена на гидролиз метилированной ДНК имеет противоположный характер. Пинеалон не влияет на гидролиз разных по метилированию ДНК, но в присутствии гистона Н1 пептид ингиби-рует гидролиз неметилированной ДНК (рис. 1а, 10), а метилированной ДНК — стимулирует (рис. 1б, 10).
126
ХАВИНСОН и др.
Рис. 2. Электрофоретическое разделение (в 20%-ном полиакриламидном геле) продуктов гидролиза флуоресцентно-меченных однотяжевого 5'-FAM-CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3' (А) и двутяжевого 5'-FAM-CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3'/3'-GCG GCG GTC CGC GGC GGC GC-FAM-5' (Б) дезоксирибоолигонуклеотидов эн-донуклеазой WEN1. 1 — олигонуклеотид 2 — 1 + фермент + Mg2+; 3 — 2 + эпиталон; 4 — 2 + бронхоген; 5 — 2 + кардиоген; 6 —2 + панкраген; 7 — 2 + пинеалон; 8 — 2 + тестаген. На Б: а — двутяжевый, б — смесь однотяжевых.
Эпиталон, бронхоген и пинеалон ингибируют гидролиз неметилированной ДНК ферментом WEN1 (рис. 1а, 14, 16, 18). В отличие от WEN2 фермент WEN1 в присутствии пинеалона полностью гидролизует неметилированную ДНК в комплексе с гистоном (рис. 1а, 19). Степень гидролиза метилированной ДНК ферментом WEN1 увеличивается эпиталоном (рис. 1б, 14).
Эпиталон, бронхоген, пинеалон, панкраген и те-стаген частично и в разной степени ингибируют ферментом WEN1 гидролиз дезоксирибоолигонук-леотида 5'-FAM-CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3', содержащего метилируемые у эукариот CNG- и CG-сайты, а кардиоген блокирует этот гидролиз (рис. 2А, 5). Панкраген, пинеалон и тестаген не влияют на гидролиз двутяжевого олигонуклеотида 5'-FAM-CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3'/3'-GCG GCG GTC CGC GGC GGC GC-FAM-5' (рис. 2Б, 6—8). Эпиталон ингибирует гидролиз од-нотяжевого олигонуклеотида (рис. 2А, 3), но стимулирует гидролиз двутяжевого (рис. 2Б, 3). Если судить по интенсивности флуоресценции полос (рис. 2Б, 3), то эпиталон способствует расплетанию цепей ДНК. Бронхоген не блокирует гидролиз одно- и двутяжевых структур, но изменяет его сайтовую специфичность. Кардиоген, в отличие от блокады гидролиза однотяжевых структур (рис. 2А), только частично подавляет гидролиз двутяжевого олигонуклеотида (рис. 2Б, 5).
Эпиталон сильно тушит флуоресценцию дез-оксирибо^'-FAM-CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3' (рис. 3А), что свидетельствует о высокой константе связывания пептида с олигонук-леотидом. Бронхоген слабее тушит его флуоресценцию. Кардиоген вообще не изменяет флуоресценцию олигонуклеотида. Между тем кардиоген полностью ингибировал гидролиз этого олигонуклеотида ферментом WEN1 (рис. 2А, 5). По-видимому, резкое подавление гидролиза ДНК кардиогеном обусловлено его взаимодействием с
ферментом, а не с ДНК. Ни один из изученных пептидов не тушил флуоресценцию меченого полидез-оксирибо-С. Следовательно, пептиды обладают сайтовой избирательностью связывания с ДНК (олигонуклеотидами). Пептиды тушат флуоресценцию и двутяжевого олигонуклеотида (рис. 3Г), т.е. они могут интеркалировать в спираль ДНК. Если судить по разной степени тушения флуоресценции (рис. 3А, Г), то пептиды предпочтительнее связываются с однотяжевыми структурами.
Выявленное нами специфическое связывание пептидов с одноцепочечными олигонуклеотида-ми имеет особое значение. В ДНК всегда есть или появляются однотяжевые участки (цепи), особенно при репликации, рекомбинации и репарации. Взаимодействие коротких пептидов именно с такими участками может контролировать эти генетические процессы. Итак, нами впервые показано, что короткие пептиды модулируют действие эндонуклеаз. Эта модуляция в основном происходит благодаря сайт-специфическому связыванию пептид—ДНК.
Нами открыта тканевая, субклеточная и возрастная специфичность метилирования ДНК [6] и впервые показано, что характер метилирования ДНК в раковых клетках иной, чем в нормальных [7]. Мы постулируем, что один и тот же биологически активный пептид будет по-разному связываться с ДНК в зависимости от ее метилирования и по-разному воздействовать на геном: в различных тканях (клетках), в ядре и митохондриях, в молодых и старых клетках, в нормальных и раковых клетках. Почти все эти постулаты подтверждены экспериментально [1, 2].
Обнаруженный нами феномен модуляции действия эндонуклеаз короткими пептидами может быть лишь частью глобального биологического закона: сайт-специфично связывающиеся с ДНК (особенно с регуляторными элементами генома) пептиды должны модулировать функции
КОРОТКИЕ ПЕПТИДЫ МОДУЛИРУЮТ ДЕЙСТВИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ
127
0 450 нм 600 нм 0 450 нм 600 нм
Рис. 3. Спектры флуоресценции флуоресцентно-меченного однотяжевого дезоксирибоолигонуклеотида 5'- FAM-CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3'
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.