дативного стресса при острой ишемии-гипоксии мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на 48 здоровых белых беспородных крысах обоего пола массой 220-250 г, содержавшихся в условиях вивария на обычной лабораторной диете. Перед постановкой эксперимента животные не получали пищу в течение 15 ч.
Манипуляции с животными проводились в соответствии с рекомендациями комиссии по этике РАМН.
Во всех сериях опытов оперативный разрез на шее в области левой сонной артерии осуществлялся под общим эфирным наркозом. В качестве острого гипоксическо-ишемического воздействия на головной мозг была использована модель острой гипоксии, описанная в работах Петерса-Шольта и соавт. [8], предлагающая перевязку одной из сонных артерий и последующую экспозицию животного в течение часа в искусственной газовой среде, содержащей 8% кислорода и 92% азота. Ишемия мозга, создаваемая перевязкой одной из сонных артерий, в экспериментальном плане ценна тем, что позволяет усугубить гипо-ксическое воздействие ишемизацией тканей. Дополнительное воздействие в такой ситуации на организм гипоксической газовой смеси усиливает дефицит кислорода в ишемизированной части мозга. Применение газовой смеси со столь низким содержанием кислорода продиктовано тем, что в силу видовых особенностей крысы обладают выраженной устойчивостью к гипоксии.
Все экспериментальные животные были разбиты на 4 группы, и выведение крыс из эксперимента во всех случаях осуществлялось путем их моментальной декапитации с помощью гильотины.
К группе 1 - контроль (К, п = 12) - были отнесены ложно-оперированные крысы, которым под эфирным наркозом делался оперативный разрез в области левой сонной артерии без ее перевязки, декапитация этих животных осуществлялась спустя 1 ч после их выдерживания в обычных комнатных условиях.
К группе 2 - гипоксия (Нр, п = 12) - были отнесены крысы, которым производилось лигирова-ние сонной артерии и которые содержались в камере с 8%-ной кислородной смесью, декапитация животных осуществлялась через 1 ч после их выдерживания в гипоксической атмосфере.
Группу 3 (Мх, п = 12) составляли ложно-оперированные животные с введением мексиданта на фоне нормоксии.
В группу 4 (Мх + Нр, п = 12) были включены крысы, получавшие мексидант на фоне гипоксическо-ишемического воздействия.
Мексидант вводили животным в дозе 10 мг/кг веса внутримышечно. Крысам 3-й группы через 1 ч после инъекции мексиданта для регистрации образования N0 вводили комплекс железа с диэтил-дитиокарбаматом (ДЭТК), после чего крыс через 1 ч пребывания в нормальных условиях декапити-ровали. Крысам 4-й группы мексидант также вводили за 1 ч до введения комплекса ДЭТК, после чего животных на 1 ч помещали в гипоксические условия, а затем декапитировали.
После декапитации извлекали головной мозг, который делили на части, часть подвергали морфологическому исследованию, часть - спектроскопическому.
Эффективность проводимой терапии оценивали с помощью морфологического исследования. После вскрытия черепной коробки часть мозга извлекали и фиксировали в течение 2 ч в смеси, состоящей из 1 части ледяной уксусной кислоты, 7 частей 96-градусного спирта, 2 частей 15%-ного формалина (соотношение 1 : 7 : 2).
Далее фиксированную ткань мозга помещали в 70-градусный спирт на 2 сут, после чего выделяли ткани левого и правого полушария вместе с корой и подкорковыми ядрами и мозжечком. Кусочки этих отделов мозга заливали парафином. Срезы ткани мозга толщиной около 5 мкм окрашивали по Нисслю с использованием крезил-вио-лета для определения дегенерации нейроцитов и гематоксилином-эозиномом для определения степени отека головного мозга путем обнаружения и подсчета в полях зрения количества перицеллю-лярного и периваскулярного отека. По окраске гематоксилин-эозином оценивали морфологические изменения, возникшие в коре, подкорковых ядрах и мозжечке головного мозга, при этом обращали внимание на состояние коры, белого вещества, подкорковых структур. При исследовании мозжечка описывали состояние его коры и белого вещества. Морфометрическое исследование проводили с помощью морфометрической сетки Автандилова [14].
N0-продуцирующую способность тканей оценивали методом ЭПР-спектроскопии с использованием спиновой ловушки по количеству парамагнитных мононитрозильных комплексов железа с ДЭТК (МНКЖ-ДЭТК), образующихся в ткани при связывании N0 с его экзогенной ловушкой - комплексами Fe2+ с ДЭТК [10]. Согласно разработанной методике [11, 12], животным в эксперименте подкожно вводили комплекс двухвалентного железа (FeS04 • 7Н20) с цитратом в 0.2 мл физиологического раствора, молярное соотношение Fe : цитрат (1 : 5) в дозе 40 мг Fe на 1 кг массы, и внутрибрюшинно 0.2 мл водного раствора ДЭТК + Fе-цитрат (500 мг/кг). Образцы ткани головного мозга (гомогенаты, по одному из каждого полушария) замораживали в жидком азоте,
Эл. отека/поле зрения 12
10
8 6 4 2 0
K
>0.05
Hp
□ L
□ R
<0.001
Mx
M
<0.05
+Hp
<0.001
Ч
>0.05
Рис. 1. Морфометрия элементов отека у экспериментальных животных в различных отделах мозга (количество элементов отека в поле зрения). К - контроль, Нр - гипоксия, МХ - контроль + мексидант, Мх + Нр -гипоксия + мексидант. L - левое полушарие, R - правое полушарие.
после чего в этих образцах регистрировали при 77°К сигнал ЭПР на радиоспектрометре (РЭ 1306 (Россия) и Брукер (США). Для оценки образующихся в тканях МНКЖ-ДЭТК + Fе (пропорционально отражающего образование в тканях NO) использовали эталонный образец МНКЖ-ДЭТК + + Fе в диметилсульфоксиде с известной концентрацией этих комплексов. Оценивали амплитуду первой компоненты триплетного сигнала N0 в отн. ед.
Оксидативно-антиоксидантный статус оценивали по первичным продуктам СРО - гидроперекисям липидов (ГПЛ) и суммарной антиокислительной активности (САА) методом хемилюми-нисценции (ХЛ). В клинической практике нашла применение методика оценки СРО и САА биологических проб с помощью регистрации активированной родамином "Ж" ХЛ в присутствии двухвалентного железа [9, 13].
В качестве стандартной системы использовали суспензию желточных липопротеидов, которую получали путем разведения желтка куриного яйца в соотношении 1 : 10 дистиллированной водой.
В кювету помещали суспензию желточных липопротеидов в объеме 0.5 мл, добавляли 0.1 мл 1 мМ раствора родамина Ж и 5 мл фосфатного буфера с рН 7.7. Для инициирования ХЛ вводили 0.5 мл 25 мМ раствора сульфата железа и 0.1 мл дистиллированной воды. Получали стандартный сигнал быстрой и медленной вспышки ХЛ. Затем исследование повторяли, но вместо дистиллированной воды добавляли 0.1 мл сыворотки крови.
Добавление сыворотки крови вызывало изменение Аб и Ам вспышки ХЛ на некоторую величину относительно исходной стандартной.
Измеряли амплитуду быстрой вспышки ХЛ (Аб), соответствующую собственному содержанию ГПЛ в суспензии желточных липопротеидов и Аб после внесения в пробу 0.1 мл сыворотки крови. Расчет ГПЛ в сыворотке крови производили в относительных единицах (Аб пробы/Аб ЖЛП X х 100), поскольку величина изменения быстрой вспышки ХЛ пропорциональна уровню ГПЛ во вносимом образце сыворотки. Расчет САА сыворотки крови также проводили в относительных единицах по Ам пробы и Ам ЖЛП.
Изменение амплитуды Ам вспышки индуцированной ХЛ в суспензии желточных липопротеидов сыворотки крови обратно пропорционально суммарной антиоксидантной активности ЖЛП и вносимой пробы сыворотки, поэтому для удобства анализа результатов использовали формулу (Ам пробы - Ам ЖЛП)/Ам ЖЛП X 100, что позволяет оценить величину САА в пробах сыворотки крови [9-14].
Результаты, полученные при исследовании, вносили в базу данных и обрабатывали с помощью системы статистического анализа Statistica v5.0. Достоверность различий анализировали с помощью ¿-критерия Стьюдента-Фишера в доверительном интервале более 95% при нормальном распределении вариационного ряда. В случае ненормального распределения вариационного ряда достоверность различий оценивали с помощью непараметрических критериев Вилкоксона и Манна-Уитни. При сравнении однородных величин различия считали достоверными при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Морфометрические количественные показатели элементов отека в различных отделах мозга у экспериментальных животных представлены на рис. 1.
Согласно этим данным, в условиях острой гипоксии-ишемии резко уменьшается количество нейроцитов за счет их деструкции, морфометрические количественные показатели элементов отека в условиях острой гипоксии-ишемии резко увеличиваются до 11.19 ± 0.99 по сравнению с контролем 3.29 ± 0.27 (р < 0.01). При введении мексиданта в условиях острой гипоксии-ишемии морфометрическая картина ткани головного мозга практически нормализуется и достигает значения 6.50 ± 0.7 элементов отека в поле зрения, где наблюдается большее количество ин-тактных клеток нервной ткани головного мозга по сравнению с группой в условиях острой гипоксии ишемии (р < 0.01). Изменения в обоих полушариях носили аналогичный характер.
<0.05
отн. ед. 15
10
5
пи
ГШ
□ L
□ R
□ C
■•Т
K Hp Mx Mx+Hp
Рис. 2. Уровень NO в различных отделах мозга крыс в условиях острой гипоксии-ишемии (отн. ед.). К -контроль, Нр - гипоксия, Мх - контроль + мексидант, Мх + гипоксия - гипоксия + мексидант. L - левое полушарие, R - правое полушарие, C - мозжечок.
Изменения уровня NO по количеству образующихся в тканях МНКЖ-ДЭТК в соответствии с массой исследуемого образца, измеряемые методом ЭПР-спектроскопии при экспозиции крыс в условиях 8%-ной кислородной атмосферы при ли-гировании левой сонной артерии, отражены на рис. 2.
Согласно этим данным, в условиях острой гипоксии-ишемии (Hp) уровень NO незначительно увеличивается до 8.61 ± 1.73 отн. ед. по сравнению с контролем 5.49 ± 1.31отн. ед. При введении мексиданта (Mx) наблюдается увеличение уровня NO до 14.40 ± 3.93 ед. только в опытной группе (Mx + Hp) в условиях острой гипоксии-ишемии (p < 0.05). Изменения наблюдались в левом полушарии, где была проведена окклюзия сонной артерии. В правом полушарии достоверные изменения не наблюдались.
Экспозиция крыс в условиях 8%-ного кислорода атмосферы при лигировании л
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.