НЕИРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 1, с. 60-64
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.8-005:577.175
КОРРЕКЦИЯ ПОСТИШЕМИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В БОЛЬШИХ ПОЛУШАРИЯХ МОЗГА С ПОМОЩЬЮ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ БИОСИНТЕЗА СУКЦИНИЛ-КОА
© 2007 г. Н. 3. Башун1, Е. Ф. Радута1, Ж. И. Балаш1, П. Ч. Кирвель1, Л. И. Сушко1,
Н. П. Канунникова1*, А. Г. Мойсеенок2
1Гродненский государственный университет им. Янки Купалы, Гродно, Беларусь; 2Институт биохимии HAH Беларуси, Гродно, Беларусь
Были изучены показатели, характеризующие ПОЛ и систему глутатиона, а также показатели энергетического метаболизма и метаболизма ГАМК в больших полушариях мозга крыс после 6 ч ишемии мозга, обусловленной окклюзией обеих сонных артерий. Показано наличие выраженного окислительного стресса в мозге и крови на фоне усиления энергетического метаболизма и угнетения ферментов катаболизма ГАМК. Совместное введение пантенола (200 мг/кг, в/бр) и сукци-ната (100 мг/кг, в/бр) успешно устраняло вышеуказанные нарушения.
Ключевые слова: ГАМК, глутамат, глутатион, мозг, ишемия, пантенол, сукцинат.
Актуальность разработки способов коррекции постишемических нарушений в мозге обусловливается широким распространением подобных патологических состояний в клинической практике, необходимостью коррегирования последствий ишемического инсульта и повреждения ЦНС, которые в настоящее время выходят на одно из первых мест среди причин нарушения трудоспособности и смертности населения в цивилизованных странах [1]. Ишемия мозга индуцирует накопление свободнорадикальных форм кислорода, генерализацию процесса в виде окислительного стресса, что влечет за собой системные повреждения нейрональных мембран [2]. Кроме того, система антиоксидантной защиты (АОЗ) в мозге имеет, очевидно, меньшую емкость, чем в других тканях, а ферментативные компоненты АОЗ в мозге более чувствительны к окислительной атаке [3].
Особенностью ишемического повреждения в мозге является также то, что недостаток кислорода приводит к выраженным нарушениям окисления энергетического субстрата, еще имеющегося в ткани мозга в достаточных количествах [2, 4]. Уже в ранние сроки гипоксии происходят нарушения энергетических функций митохондрий, что сопровождается обращением конечных этапов ЦТК. Образующийся при этом сукцинат играет важную роль в поддержании энергетического обмена, в частности, в переключении с НАД-зависимой на ФАД-зависимую энергопродукцию,
* Адресат для корреспонденции: 230012, Беларусь, г. Гродно, пер. Доватора, 3/1; e-mail: n.kanunnikova@grsu.by
устранении избытка ацетил-КоА, обеспечении работы ЦТК в условиях гипоксии [5-7].
С точки зрения поиска новых средств, предохраняющих мозг от последствий ишемии, представляется перспективным использование средств метаболической терапии, направленных на восстановление энергетического метаболизма в клетках мозга [6]. В их числе апробированы препараты янтарной кислоты (сукцината), применение которых позволяет поддерживать энергетический обмен в клетках в условиях гипоксии [6, 8].
Ранее нами была показана высокая эффективность производных пантотеновой кислоты -предшественников кофермента А (КоА), как протекторов клеточных мембран при таких видах окислительного стресса, как действие ионизирующего излучения, голодание, диабет [9]. Из производных пантотеновой кислоты большой интерес представляет D-пантенол, который, будучи спиртовым производным, исключительно легко проникает в мозг через гематоэнцефалический барьер, биотрансформируется в пантотенат, 4'-фосфо-пантотенат и КоА. Это создает предпосылки для стабилизации КоА-зависимых процессов биосинтеза фосфолипидных компонентов мембран, нейромедиаторов, регуляции энергетических процессов [8]. Сочетание предшественника КоА (пантенола) и сукцината может быть полезным в обеспечении высокой степени нейро-протекции при ишемии мозга.
Исходя из изложенного выше, цель данного исследования - изучение показателей, характеризующих активность ПОЛ (уровень продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой -
ТБК-РП в крови и мозге), состояние основной системы антиоксидантной защиты в ЦНС - системы глутатиона, а также активность ферментов метаболизма ГАМК и глутамата и некоторых ферментов ЦТК в больших полушариях мозга крыс при коррекции ишемических нарушений мозгового кровообращения препаратами D-пан-тенола и сукцината.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Моделирование ишемии мозга осуществляли на фоне тиопенталового наркоза (50 мг/кг, в/бр) путем накладывания двусторонней лигатуры на сонные артерии. Контрольным животным производили ложную операцию на фоне тиопенталового наркоза. Тромбоз сосудов предупреждали в/бр введением кальципарина в дозе 125 иЕ/кг в момент операции.
После декапитации животных быстро извлекали мозг, выделяли большие полушария, которые немедленно замораживали в жидком азоте. Изучение биохимических показателей проводили в больших полушариях мозга, так как основные морфологические нарушения и изменения биохимических показателей после перевязки общих сонных артерий наблюдаются именно в этой структуре мозга [10].
Исходный уровень ТБК-реагирующих продуктов и наработку МДА в присутствии железоас-корбатного комплекса измеряли в соответствии с методическими рекомендациями Куклей и др. [11].
Восстановленный глутатион (GSH) определяли в реакции с 5, 5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой (ДТНБ) по классическому методу [12]. Активность глутатионтрансферазы (ГТ) измеряли в соответствии с методом [13], глутатионре-дуктазы (ГР) - по методу [14], глутатионперокси-дазы (ГПО) - по методу [15].
Активность глутаматдекарбоксилазы ^-глута-мат-карбоксилазы, НФ 4.1.1.15, ГДК) определяли флуориметрическим методом [16], ГАМК-амино-трансферазы (ГАМК-Т, 4-аминобутират-2-оксо-глутарат-аминотрансфераза, НФ 2.6.1.19) и де-гидрогеназы янтарного полуальдегида (ЯПА: НАД+ оксидоредуктаза, НФ 1.2.1.24) также определяли флуориметрическим методом с модификациями [17]. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ, НФ 1.3.99.1 сукцинат-оксидоредуктаза) [18] и 2-оксоглутаратдегидрогеназы (2-ОГДГ, 2-оксо-глутарат: липоатоксидоредуктаза, НФ 1.2.4.2.) определяли спектрофотометрически [19]. Активность глутаматдегидрогеназы также опреде-
ляли сиектрофотометрическим методом [20]. В экспериментах исиользовали субстанцию D-пан-тенол производства F. Hoffman-La Roche, Basеl, Швейцария. Сукцинат вводили в виде предварительно нейтрализованного с помощью NaOH (до рН 7.4) препарата янтарной кислоты производства Реахим. Препараты вводили внутрибрюшинно.
Содержание белка в гомогенатах тканей определяли методом Hartree [21]. Достоверность различий между отдельными группами оценивали с помощью ¿-теста.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Эффекты D-пантенола в комбинации с сукци-натом изучали после 6 ч ишемии, так как к этому времени наблюдается значительная активация энергетического метаболизма в больших полушариях мозга[9, 22].
Препараты D-пантенола (200 мг/кг, в/бр) и сукцината (100 мг/кг, в/бр) вводили трехкратно -за 1 час до операции, в момент перевязки сонных артерий и через 2 часа после перевязки.
Наши исследования показали, что после 6 ч ишемии развивались выраженные явления окислительного стресса, которые проявлялись в увеличении исходного уровня ТБК-РП не только в ткани мозга, но и в плазме крови (табл. 1).
Как следует из представленных данных, комбинация пантенола с сукцинатом, а также введение одного сукцината эффективно снижали уровень ТБК-РП в плазме до контрольных значений. Наработка ТБК-РП оказалась несколько сниженной на фоне ишемии и практически не изменялась при действии препаратов (некоторая стимуляция сукцинатом). Конечные продукты окислительного стресса в крови экспериментальных животных возрастали и имели тенденцию к снижению при метаболической коррекции.
Достаточно заметными оказались эффекты использованной комбинации препаратов в устранении нарушений системы глутатиона (табл. 2).
Так, после 6 ч ишемии мозга была достоверно повышена активность и глутатионредуктазы, и глутатионпероксидазы, что, очевидно, свидетельствует об усилении функционирования системы глутатиона в этих условиях, несмотря на отсутствие достоверных изменений уровня восстановленного глутатиона. Совместное введение пантенола и сукцината способствовало возвращению активности ферментов обмена глутатиона к значениям контрольной группы, однако уровень восстановленного глутатиона при этом достоверно снизился. В достижении указанных эффектов очевиден вклад обоих метаболитов, но в отношении глутатионпероксидазы имело место сочетан-ное воздействие, а уровень глутатиона снижался благодаря введению сукцината.
62
БАШУН и др.
Таблица 1. Исходное содержание и наработка ТБК-РП (нмоль/мг белка) в больших полушариях мозга крыс и плазме крови (нмоль/мл плазмы) при назначении сукцината и Б-пантенола после 6 ч ишемии мозга
Группы Большие полушария мозга Плазма крови
ТБК-РП ДТБК-РП ТБК-РП
Контроль 2.39 ± 0.41 35.69 ± 2.0 22.56 ± 1.025
Ишемия 6.95 ± 1.75* 26.95 ± 1.75* 33.06 ± 2.8*
Ишемия + пантенол 5.24 ± 1.52* 28.70 ± 3.16 25.77 ± 2.92
Ишемия + сукцинат 3.04 ± 0.2# 32.42 ± 0.86# 17.3 ± 1.02*
Ишемия + пантенол + сукцинат 3.25 ± 0.73# 28.77 ± 1.16* 20 ± 1.89
* р < 0.05 по сравнению с контролем. #р < 0.05 по сравнению с группой ишемии.
Таблица 2. Показатели системы глутатиона в больших полушариях мозга крыс при действии сукцината (100 мг/кг, в/бр) и Б-пантенола (200 мг/кг, в/бр) после 6 ч ишемии мозга
Группы ГР, нмоль НАДФН/мин* мг белка ГТ, нмоль ХДНБ/мин* мг белка ГПО, нмоль GSH/мг белка GSH, мкмоль/г ткани
Контроль 24.49 ± 1.27 107.00 ± 6.32 44.18 ± 2.45# 1.32 ± 0.035
Ишемия 34.07 ± 1.42* 97.25 ± 4.20 58.31 ± 3.15 1.16 ± 0.07
Ишемия + пантенол 26.42 ± 1.34 107.33 ± 12.5 48.47 ± 2.29# 1.18 ± 0.143
Ишемия + сукцинат 28.71 ± 1.06* 106.31 ± 9.9 52.74 ± 4.94 0.93 ± 0.11*#
Ишемия +пантенол + сукцинат 29.56 ± 2.79 112.79 ± 9.94 37.97 ± 3.52# 1.07 ± 0.05*
* р < 0.05 по сравнению с контролем. #р < 0.05 по сравнению с группой ишемии.
Что касается ферментов метаболизма ГАМК (рисунок),
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.