РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 1, с. 86-92
^ РАДИАЦИОННАЯ ^^^^^^^^^^^^^^
ЦИТОГЕНЕТИКА
УДК 612.42:612.014.464
КОРРЕЛЯЦИЯ МЕЖДУ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ОКСИДА АЗОТА И ЧАСТОТОЙ МУТАНТНЫХ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ
© 2007 г. И. А. Замулаева*, Н. В. Орлова, С. Г. Смирнова, С. Я. Проскуряков, А. С. Саенко
Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Исследована возможная взаимосвязь внутриклеточного содержания оксида азота с уровнем соматического мутагенеза после низкоинтенсивного облучения в малых дозах. С помощью проточной цитометрии определены содержание NO и частота лимфоцитов с мутациями по локусу Т-клеточно-го рецептора (T-cell receptor - TCR). Обследовано 64 работника атомной промышленности со средней (±SE) накопленной дозой 114.9 ± 10.8 мЗв, полученной за 21.4 ± 1.1 лет профессиональной деятельности, а также 66 необлученных контрольных лиц сходного возраста. Средняя частота TCR-му-тантных клеток составила в этих группах (6.1 ± 1.0) х 10-4 и (4.1 ± 0.2) х 10-4 соответственно (р = = 0.06). У 14% работников атомной промышленности частота мутантных клеток выходила за пределы 95%-ного доверительного интервала, установленного для контрольной группы. Показана корреляция внутриклеточного содержания NO и частоты мутантных клеток (R = 0.36, p < 0.01). Среднее содержание NO у работников с повышенной частотой мутантных клеток было статистически значимо выше, чем у остальных лиц: 1619 ± 57 vs 1340 ± 40 относительных единиц соответственно (p = 0.01). Полученные результаты свидетельствуют о роли оксида азота в увеличении количества мутантных лимфоцитов у части лиц после радиационного воздействия в малых дозах, не исключая участия этого соединения в формировании нестабильности генома клеток.
Лимфоциты, малые дозы, соматические мутации, оксид азота, нестабильность генома, проточная цитометрия.
Воздействие ионизирующих излучений приводит к усилению продукции оксида азота в клетках разнообразных биологических объектов, включая человека. Показано, что при этом может происходить как увеличение экспрессии индуцибель-ной NO-синтазы, так и активация конститутивной формы этого фермента [1-3]. Как стало понятно в последние годы, биологические эффекты этих изменений могут быть многообразны [4, 5], включая усиление мутационного процесса. Установлены защитные свойства ингибиторов N0-синтаз в отношении генотоксического действия радиационных и химических факторов на клеточные культуры [2, 6, 7]. Критерий защитного действия ингибиторов в указанных работах - уменьшение числа хромосомных аберраций и микроядер в близкие сроки после воздействия.
Отдельный интерес представляет вопрос о влиянии радиации в малых дозах на продукцию и/или содержание оксида азота, а также о возможных последствиях такого влияния. Имеются убедительные данные, что радиационное воздействие в малых дозах также индуцирует выраженные изменения в системе регуляции N0, что,
*Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., Королева, 4, ГУ МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 7-48-47; факс: (495) 956-14-40; e-mail: zamulaeva@mail.ru.
в свою очередь, приводит к увеличению его содержания в клетках и внеклеточной среде [8-11]. Можно предположить, что и в этом случае будет наблюдаться связь повышенного содержания NO, например, с количеством мутаций. Ранее нами было показано, что у 15-20% лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах, частота клеток с мутациями по локусу Т-клеточно-го рецептора (T-cell receptor - TCR) выходит за границы 95% доверительного интервала, установленного для контрольной группы [12]. При этом у остальных лиц распределение этого показателя соответствует таковому в контроле. Причины установленного различия в индивидуальной реакции на облучение в малых дозах требуют дальнейшего исследования. Поэтому цель данной работы - изучение возможной взаимосвязи внутриклеточного содержания оксида азота с уровнем соматического мутагенеза после низкоинтенсивного облучения в малых дозах. В работе проведено обследование работников атомной промышленности, дозы облучения которых могут быть определены с максимальной на сегодняшний день точностью. В качестве показателя соматического мутагенеза исследована частота TCR-мутант-ных лимфоцитов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ
Группу исследования составили 64 сотрудника Государственного научного центра - Физико-энергетического института (г. Обнинск), находящихся под индивидуальным дозиметрическим контролем. Обследованные нами лица подверглись радиационному воздействию в средней дозе (^Е 114.9 ± 10.8 мЗв, накопленной за 21.4 ± 1.1 лет профессиональной деятельности. Средний возраст (±Ж) обследованных сотрудников составил 55.4 ± 0.9 лет.
Группа контроля состояла из 66 здоровых лиц сходного возраста, не подвергавшихся зарегистрированным генотоксическим воздействиям, в том числе радиационным. Средний возраст (±Ж) контрольных лиц составил 54.8 ± 0.9 лет. Место проживания контрольных лиц (г. Обнинск) также (как и возраст) соответствовало таковому в группе исследования.
Исследование генных мутаций по TCR- локусу
Для оценки уровня соматического мутагенеза использован метод определения мутаций по ТСК-локусу, как подробно описано ранее [13]. Принцип этого метода, разработанного японскими авторами, состоит в следующем [14]. На поверхности Т-лимфоцитов экспрессирован комплекс Т-клеточного рецептора и CD3-антигена. Так как TCR-гены функционально гемизиготны, на поверхности лимфоцитов представлены продукты только одного аллеля. Мутация в функционирующем аллеле приводит к тому, что CD3 комплекс не экспрессируется на поверхности Т-лимфоцита. Такие мутанты определяются с помощью проточной цитометрии как CD3-негативные среди CD4-позитивныx Т-клеток. Для идентификации мутантных клеток используют моноклональные антитела, меченные разными флуорохромами, к CD3- и CD4-антигенам. С помощью специальной компьютерной программы подсчитывают частоту мутантных клеток. Критерием повышенной частоты мутантных клеток является превышение верхней границы 95%-ного доверительного интервала, установленного в контроле.
Определение содержания оксида азота в лимфоцитах
Для определения внутриклеточного содержания N0 использован метод, предложенный в 1998 г. Коута et а1. [15]. Метод основан на применении 4,5-диаминофлуоресцеин-2-диацетата (ДАФ-ДА), легко проникающего через плазматическую мембрану, а затем подвергающегося в клетке воздействию эстераз. Продукт этой реакции теряет способность проникать через плазмалемму, поэтому остается в клетке и взаимодействует с N0. В результате этой реакции в присутствии кисло-
рода образуется диаминофлуоресцеин-триазол (ДАФ-ТР), который обладает флуоресценцией с высоким квантовым выходом в диапазоне 500520 нм при возбуждении 488 нм. С помощью проточной цитометрии измеряют (в указанном диапазоне длин волн) интенсивность флуоресценции каждой клетки, которая пропорциональна содержанию NO при концентрации последнего более 2-5 нмоль/л [16].
Известно, что любая процедура получения фракции мононуклеарных клеток из цельной крови неизбежно связана с повреждением определенной части из них. Как показано ниже (в главе "Результаты"), флуоресценция ДАФ-ТР в клетках с поврежденной плазматической мембраной существенно снижена по сравнению с неповрежденными клетками. Поэтому было сделано заключение о необходимости оценки целостности плазмалеммы одновременно с измерением изучаемого параметра и его определении только в неповрежденных клетках. В данной работе для оценки целостности плазмалеммы использовали иодистый пропидий (ИП), который характеризуется интенсивным поглощением в диапазоне 488 нм, как и ДАФ-ТР, что допускает использование однолазерной проточной цитометрии. Интенсивность флуоресценции ДАФ-ТР определяли среди ИП- неповрежденных лимфоцитов, как подробно описано далее.
В нашей работе материалом для исследования были клетки периферической крови сотрудников ГНЦ-ФЭИ. Венозная кровь обследуемых лиц была помещена в пробирки с гепарином и транспортирована к месту анализа в течение 1 ч. 25 мкл крови инкубировали с 0.5 мл раствора, лизирую-щего эритроциты ("Becton Dickinson Immunocy-tometry Systems"-"BDIS", США), в течение 11 мин при комнатной температуре. Оставшиеся клетки отмывали 3 раза в 0.01 моль/л фосфатным буфере, содержащем 0.15 моль/л №Cl (ФБ, рН 7.2), с помощью центрифугирования (300g, 5 мин). К осадку добавляли 10 мкмоль/л раствор ДАФ-ДА ("Sigma", США) в ФБ и инкубировали в течение 1 ч при +37°С. Затем к суспензии приливали раствор ИП ("Sigma", США) в конечной концентрации 50 мкг/мл, инкубировали еще 10 мин и анализировали с помощью проточного цитометра FACS Vantage ("BDIS", США), оборудованного 488 нм лазером (Spectra-Physics 177, США). Для измерения флуоресценции ДАФ-ТР использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, ИП - 585/30 нм. Мощность лазера составляла 56 мВт.
Компьютерную обработку проводили с помощью программы CellQuestPro ("BDIS", США). На графике распределения клеток по интенсивности бокового светорассеяния и флуоресценции ИП выделяли регион неповрежденных лимфоцитов, т.е. ИП отрицательных клеток с низким боковым
светорассеянием. Далее оценивали среднюю интенсивность флуоресценции ДАФ-ТР (в относительных единицах - каналах анализатора) среди выделенных клеток. В каждом образце анализировали 5 х 104 клеток.
Определение содержания оксида азота
в ФГА-стимулированных лимфоцитах
С помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина ("Панэко", РФ, плотность 1.077) из 3 мл крови выделяли моно-нуклеарную фракцию клеток. При этом кровь, разбавленную в 2 раза раствором Хенкса ("Панэко", РФ), наслаивали на 3 мл раствора фиколл-урографина и центрифугировали в течение 30 мин при 250 g. Клетки из слоя мононуклеаров собирали, отмывали 2 раза раствором Хенкса ("Панэко", РФ) и помещали в среду RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащую 10% инактивированной фе-тальной сыворотки ("Sigma", США), 80 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/л глютамина ("Панэко", РФ), 20 ммоль/л Hepes ("Sigma", США) и 45мкг/мл ФГА ("Панэко", РФ). Концентрация клеток составляла 2 х 10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.