УДК 577.352.465
КРАТКОВРЕМЕННАЯ ГИПОКСИЯ ВЫЗЫВАЕТ СЕЛЕКТИВНУЮ ГИБЕЛЬ
ГАМКергических НЕЙРОНОВ
© 2013 г. М. В. Туровская, Е. А. Туровский, А. В. Кононов, В. П. Зинченко*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
*электронная почта: vpz@mail.ru Поступила в редакцию 17.05.2013 г.
Известно, что кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели при глобальной гипоксии и ишемии (гипоксическое прекондиционирование). Эти же воздействия вызывают пост-гипоксическую гипервозбудимость в период реоксигенации, что может привести к гибели отдельных популяций нейронов, отличающихся повышенной чувствительностью к гипоксии. В настоящей работе сравнили действие кратковременной гипоксии на развитие эффектов прекондициони-рования и постгипоксической гипервозбудимости в двух популяциях нейронов: тормозных ГАМКергических и возбуждающих глутаматергических. Эффект прекондиционирования оценивали по степени подавления активности ММБЛ-рецепторов. Постгипоксическую гипервозбудимость регистрировали по появлению спонтанного синхронного Са2+-спайка в нейрональной сети в период реоксигенации после каждого эпизода гипоксии. Показано, что эффект прекондиционирования развивается только в глутаматергических нейронах и отсутствует в ГАМКергических. Активность ММБЛ-рецепторов в этих нейронах не подавляется, а возрастает после каждого эпизода гипоксии. В момент генерации постгипоксического синхронного Са2+-спайка в части ГАМКергических нейронов происходит глобальное повышение базального уровня Са2+ с последующей их гибелью. Противовоспалительный цитокин интерлейкин-10 (ИЛ-10) препятствует развитию постгипоксической гипервозбудимости, ингибируя спонтанный синхронный Са2+-спайк, и защищает ГАМКергиче-ские нейроны от гибели, восстанавливая в них эффект прекондиционирования. Ингибиторы Р13-киназы — вортманнин и 1У294.002 — препятствуют развитию защитного эффекта ИЛ-10, отменяя ингибирующий эффект ИЛ-10 на генерацию спонтанного синхронного Са2+-спайка. Полученные данные указывают на ведущую роль ГАМКергических нейронов в развитии постгипоксической гипервозбудимости. Предполагается, что возникновение гипервозбудимости в нейрональной сети обусловлено ослаблением тормозного влияния ГАМКергических нейронов. Активация различных сигнальных путей, ведущих к росту фосфорилирования, зависящего от протеинкиназ В и О, в нейронах этого типа является возможной стратегией защиты нервных клеток при гипоксии.
Ключевые слова: гипоксия, гипервозбудимость, Са2+, ММБЛ-рецептор, ГАМКергические нейроны, селективная гибель.
DOI: 10.7868/S0233475513050198
Причиной многих нейродегенеративных процессов в головном мозге является локальная ишемия, развивающаяся вследствие нарушения кровообращения. Чувствительность нейронов центральной нервной системы к депривации кислорода связана с нарушением ионного гомео-стаза клеток и большим количеством высвобождающегося возбуждающего нейротрансмиттера глутамата [1]. Развивающийся при этом продол-
Сокращения: NMDA — N-метил-Д-аспартат; ГАМК — у-аминомасляная кислота; PI3K —фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат-3-киназа; DIV — дни in vitro (days in vitro); U73122 — ингибитор фосфолипазы С; GAD65/67 — глута-матдекарбоксилаза 65/67; АФК — активные формы кислорода; NOS — NO-синтетаза; PLC — фосфолипаза С; IP3 — инозитолтрисфосфат.
жительный вход Са2+ через глутаматные рецепторы-каналы считается ключевым фактором гибели нейронов при ишемии и гипоксии [2, 3].
В отличие от длительной ишемии кратковременные эпизоды гипоксии вызывают противоположный эффект, направленный на защиту клеток от гибели (явление прекондиционирования). В развитии гипоксического прекондиционирования могут принимать участие различные факторы: аденозиновые рецепторы A1 типа [4], ATP-за-висимый калиевый канал [4], NOS [5], HIF [6, 7], NMDA-рецепторы [8] и др. Однако молекулярные механизмы этого типа адаптации клеток в настоящее время изучены недостаточно.
Различными методами показано, что кратковременная гипоксия или ишемия кроме прекон-
диционирования вызывают эффект гипервозбудимости в нейрональной сети in vitro и увеличение активности в различных отделах головного мозга in vivo [9—11]. Установлено, что после каждого эпизода гипоксии и кратковременной аппликации NMDA во время реоксигенации в нейронах гиппокампа в культуре наблюдается синхронный спонтанный Са2+-спайк, который является симптомом постгипоксической гипервозбудимости [11].
Противовоспалительный цитокин интерлей-кин 10 (ИЛ-10) подавляет это проявление гипервозбудимости [12]. Защитный эффект ИЛ-10, наблюдаемый при воздействии глутамата [13], ли-пополисахарида [14] и ишемии [15], обусловлен активацией сигнальных путей Р13-киназы и STAT-3. В экспериментах на нейрональной культуре нами показано, что ИЛ-10 подавляет возникновение постгипоксической гипервозбудимости в период реоксигенации после действия кратковременной гипоксии, ингибируя 1Р3-зави-симую мобилизацию Са2+ из внутриклеточных структур [12], происходящую, как установлено ранее, и при воздействии кратковременной гипоксии [16].
В настоящей работе сравнили влияние кратковременной гипоксии на развитие эффектов пре-кондиционирования и постгипоксической гипервозбудимости в двух популяциях нейронов — тормозных ГАМКергических и возбуждающих глутаматергических. Эффект прекондициониро-вания оценивали по степени подавления активности NMDA-рецепторов. Явление постгипокси-ческой гипервозбудимости регистрировали по появлению спонтанного синхронного Са2+-спай-ка в нейрональной сети в период реоксигенации после каждого эпизода гипоксии. Показано, что кратковременные эпизоды гипоксии вызывают эффект гипоксического прекондиционирования только в глутаматергических, но не в ГАМКерги-ческих нейронах. Активность NMDA-рецепторов в ГАМКергических нейронах не подавляется, а возрастает после каждого эпизода гипоксии. При этом, возникающий в сети синхронный спонтанный Са2+-спайк, индуцирует глобальное повышение Са2+ в цитозоле и вызывает селективную гибель только в популяции ГАМКергических нейронов. Противовоспалительный цитокин ИЛ-10 препятствует развитию постгипоксиче-ской гипервозбудимости, ингибируя спонтанный синхронный Са2+-спайк и защищает ГАМКерги-ческие нейроны от гибели, восстанавливая в них эффект прекондиционирования. Предполагается, что нейропротекторное действие ИЛ-10 обусловлено активацией сигнального пути выживания клеток с участием Р13-киназы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура клеток гиппокампа. В экспериментах использовали смешанную нейроглиальную культуру клеток гиппокампа крысы, выделенную из головного мозга новорожденных (1—3 дня) крыс Sprague-Dawley в соответствии с [17]. В суспензию клеток добавляли глутамин (0.5 мМ), B-27 (2%) и гентамицин (20 мкг/мл). Суспензию (100 мкл) помещали в стеклянное кольцо диаметром 6 мм, стоящее на круглом покровном стекле диаметром 25 мм (VWR International, США), обработанном полилизином из расчета один гиппо-камп на 10 стекол. Затем препараты помещали в СО2 инкубатор на 5 ч при 37°С для прикрепления клеток. После этого кольца удаляли. Каждые 3 дня среду культивирования на 2/3 заменяли на свежую. Исследовали влияние кратковременных эпизодов гипоксии на амплитуду кальциевого ответа на аппликацию агониста NMDA-рецепторов в безмагниевой среде.
Регистрация внутриклеточной концентрации Са2+. Концентрацию цитозольного кальция измеряли с помощью флуоресцентного зонда Fura-2. Для возбуждения и регистрации флуоресценции использовали фильтры BP340/30 и BP387/15, све-тоделительную пластинку FT-409 и эмиссионный фильтр BP510/90. Внутриклеточную концентрацию ионов кальция в клетках, нагруженных кальциевым зондом, регистрировали с помощью системы анализа изображений Cell observer (Carl Zeiss, Германия) на базе моторизованного микроскопа Axiovert 200М с высокоскоростной монохромной CCD-камерой AxioCam HSm и с высокоскоростным устройством смены фильтров, Ludl МАС5000. Амплитуду кальциевых ответов выражали через отношение интенсивности флуоресценции, возбуждаемой при 340 и 380 нм.
Создание кратковременных эпизодов гипоксии.
В эксперименте использовали культуру гиппокампа на 8—10 день культивирования (DlV). Измерения проводили при температуре 28°С. Для подачи веществ использовали систему, позволяющую добавлять агонисты и антагонисты рецепторов при полной смене среды. Для создания гипоксии в ячейку с клетками подавали среду (солевой раствор Хенкса с 20 мМ HEPES), из которой предварительно в течение 20 мин вытесняли кислород с помощью продувки аргоном, при этом воздушная часть ячейки также была заполнена аргоном. Уровень кислорода в гипоксическом растворе, измеренный электродом Кларка, составлял 50—60 мм. рт. ст., что соответствует условиям умеренной гипоксии.
Эксперимент состоял из трех кратковременных эпизодов гипоксии по 3 мин, каждый из которых сменялся 10-минутной реоксигенацией. Аппликацию NMDA производили перед первым эпизодом гипоксии (контроль) и после каждого из трех эпизодов гипоксии—реоксигенации. Вре-
мя аппликации агонистов составляло 30 с с последующей отмывкой агониста в 10 мл среды. Эффекты гипоксии на нейроны оценивали по изменению амплитуды кальциевого ответа клеток на NMDA до и после каждого эпизода гипоксии.
Для построения графиков и статистической обработки использовали программу OriginPro 8.0. В случае кратковременного (транзиторного) сигнала амплитуду измеряли по максимальному значению флуоресценции за период аппликации вещества. Ошибка среднего при измерении амплитуд составляла 0.04. Исходный уровень сигнала в клетках обычно составлял 0.23 ± 0.07 (здесь и далее среднее значение ± стандартное отклонение). Чтобы отличить нейроны от астроцитов применяли кратковременную аппликацию 35 мМ KCl в конце каждого эксперимента.
Определение жизнеспособности клеток. Число жизнеспособных и мертвых клеток определяли с помощью двойного окрашивания Hoechst 33 342 (1 мкг/мл) и иодидом пропидия (1 мкг/мл). Hoechst 33342, флуоресцирующий голубым светом, свободно проникает через плазматическую мембрану и прокрашивает хроматин клеток, а иодид пропидия, флуоресцирующий красным светом, пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.