ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 2, с. 67-81
= ОБЗОРЫ =
УДК 577.95;575;591.3;592/599
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭМБРИОНОВ И ГАМЕТ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
© 2015 г. С. Я. Амстиславский*, **, Е. Ю. Брусенцев*, К. А. Окотруб***, И. Н. Рожкова*
*Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, д. 10 **Новосибирский государственный университет 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, д. 2 ***Институт автоматики и электрометрии СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Коптюга, д. 1 E-mail: amstis@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 17.08.2014 г. Окончательный вариант получен 03.11.2014 г.
Обзор посвящен различным аспектам применения криоконсервации эмбрионов и гамет для создания криобанков лабораторных животных. Особое внимание уделено рассмотрению механизмов криопо-вреждений и криозащиты при замораживании и витрификации. Обсуждаются проблемы, возникающие при создании криобанков различных видов животных и перспективы их преодоления.
Ключевые слова: криоконсервация, преимплантационные эмбрионы, гаметы, лабораторные животные.
Б01: 10.7868/80475145015020020
Криоконсервация эмбрионов и гамет широко используется для сохранения генетических ресурсов лабораторных, а также сельскохозяйственных, редких и исчезающих видов животных (СоштюИ й а1., 2009; Амстиславский, Трукшин, 2010; Л§еа, 2012). Несмотря на то, что уже успешно заморожены эмбрионы и гаметы нескольких десятков видов млекопитающих (Р1еке1 й а1., 2007; 8ага§из!у, Лгау 2011), а криобанки генетических ресурсов стали рутинной практикой работы генетических центров (Яа11 е! а1., 2000; Ьапёе1, 2005; 2010; Уо8Ык1, 2009) до сих пор не существует единого универсального протокола замораживания и оттаивания эмбрионов даже для мышей. В некоторых генетических центрах, в которых созданы криобанки различных линий мышей и крыс, предпочитают использовать программное замораживание (Яа11 е! а1., 2000; Ьапёе1, 2005; 2010), в других — исключительно витрификацию (Ус^ЫИ, 2009). Между тем, за прошедшие несколько десятилетий криобиология развивалась весьма успешно и, в результате, удалось достигнуть существенного прогресса в понимании механизмов криоповреждения и криозащиты (Ма2иг, 1990). В последнее время появились новые подходы к исследованию этих вопросов, с использованием современных методов физики (Око!гиЪ е!а1., 2013). Более того, с возрастанием требований к экепериментам на животных и с появлени-
ем большого числа линий мышей и других приоритетных лабораторных животных, организация криобанков стало одним из основных атрибутов современных генетических центров (Agca, 2012). Целью данной статьи является обзор современных методов сохранения генетических ресурсов лабораторных животных значимых для биомедицинских исследований в связи с проблемами теоретической криобиологии и практическими аспектами создания криобанков.
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ПРИОРИТЕТНЫЕ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Расшифровка генома человека (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004) подняло на новый уровень поиск способов лечения различных болезней. Расшифрованы геномы и многих других видов животных, в том числе мыши (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002), крысы (Rat Genome Sequencing Project Consortium, 2004), собаки (The Canine Genome Sequencing Project, 2005), кошки (NISC Comparative Sequencing Program, 2007), Данио-рерио (Howe et al., 2013), свиньи (Groenen et al, 2012) и других. Эти достижения расширили возможность выбора соответствующих лабораторных животных для
определения функций генов и тестирование новых терапевтических подходов.
Мышь, в настоящее время, является, пожалуй, важнейшим и наиболее широко востребованным лабораторным животным (Abbott, 2004; Gondo et al., 2009; Flint, Eskin, 2012). Однако при решении некоторых задач современной биологии мышь не является наиболее адекватным объектом исследования (Seok et al., 2013). Так, например, механизмы артериальной гипертензии изучают преимущественно на крысах, это же относится и к некоторым другим заболеваниям, имеющим полигенную основу (Pinto et al., 1998; De Artinano, Castro, 2009). Помимо мышей и крыс, приоритетными лабораторными животными для биомедицинских исследований являются собаки, кошки, свиньи, овцы, обезьяны и данио-рерио, последние известны в англоязычной литературе как "zebrafish" (Mazur et al., 2008; Agca, 2012).
Собака активно использовалась в экспериментальной биологии и медицине в XIX—XX веках (Liard et al., 1974; Мяленкова, 1994). В настоящее время собака все еще выступает в качестве лабораторного животного, хотя редко (Agca, 2012). Кошек также до сих пор применяют в качестве лабораторных животных (Agca, 2012). Благодаря сходству кошачьего генома с геномом человека (Driscoll et al., 2009) и сходным клиническим проявлениям некоторых заболеваний у человека и кошки, последняя незаменима для проведения некоторых медицинских исследований (Griffin, Baker, 2002).
Свиней используют в качестве лабораторных животных в различных исследованиях связанных с хирургией, трансплантологией, фармакологией (Whyte, Prather, 2011). Помимо обычных свиней все чаще в экспериментах стали применять мини-свиней (Тихонов, Бобович, 2011).
Данио-рерио (Danio rerio) является тропической пресноводной рыбкой, которая в природе обитает в Индии и некоторых соседних с ней странах (Беляева и др., 2010). Этот известный аквариумистам вид рыб стал за последние десятилетия очень значимым, так как оказалось, что геном данио-рерио имеет много сходства с геномом человека (Howe et al., 2013). Эти небольшие рыбки хорошо размножаются в неволе, неприхотливы, требуют минимальных затрат на поддержание вида в культуре. Данио-рерио используют в исследованиях по генетике и биологии развития, а также в качестве экспериментального объекта при создании новых лекарственных препаратов и моделировании патологических процессов (Bergh-mans et al., 2008; Беляева и др., 2010).
Существует много других видов животных, без которых невозможно решить определенные задачи. Например, в силу особенностей преимпланта-ционного развития, впервые возможность успеш-
ного клонирования на млекопитающих удалось продемонстрировать на овцах. Этот "эксперимент века" закончился рождением знаменитой Долли (Campbell et al., 1996). Тем не менее, несмотря на то, что множество важных экспериментов проводятся на различных видах млекопитающих, рыб, птиц и представителей других таксонов, мы, в данном обзоре, ограничимся лишь теми видами лабораторных животных, которые считаются приоритетными именно для биомедицинских исследований (Mazur et al., 2008; Agca, 2012).
ЗАДАЧИ КРИОБАНКА ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
Создание криобанка гамет и преимплантаци-онных эмбрионов лабораторных животных имеет несколько основных задач. Важнейшей из них является сохранение генетических ресурсов видов, линий и популяций животных (Вепринцев, Ротт, 1984). Часто криобанки имеют целью сохранить биоразнообразие того или иного вида млекопитающих (Амстиславский, Трукшин, 2010; Амсти-славский и др., 2014). Если численность особей того или иного вида животных достигает некоего критического минимума, велика вероятность потери данного вида (Frankham, 2003). При уменьшении численности популяции возрастает опасность генетического дрейфа, генетической нестабильности и потери особей в результате болезней (Frankham, 2003; Amstislavsky et al., 2008). Наличие криобанка генетических ресурсов того или иного вида позволяет свести к минимуму риск потери вида и его биоразнообразия (Andrabi, Maxwell, 2007).
Применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в сочетании с клеточными и геномными инструментами привело к созданию множества трансгенных и нокаутных животных, которые вносят существенный вклад в биомедицинские исследования, начиная от анализа функций гена до сравнительных исследований разнообразных патологий у человека (Bockamp et al., 2002; Adams, Weiden, 2008; Gondo et al., 2009). На сегодняшний день получены тысячи новых трансгенных, нокаутных и мутантных линий мышей (Abbott, 2004), крыс (Jacob et al., 2010), а также данио-рерио (Ekker, 2008) и ряда других видов животных. Поддержание большого числа линий лабораторных животных необходимых для проведения современных медико-биологических исследований невозможно без организации крио-банка зародышей, гамет и стволовых клеток (Abbott, 2004; Landel, 2005; Ekker, 2008; Agca, 2012).
Наличие криобанка повышает эффективность работы генетических центров путем снижения финансовых затрат и оптимизации их деятельности, помогая ассоциировать их в международные
федерации ресурсов лабораторных животных (Landel, 2005; FIMRe, 2006). Упрощается обмен линиями лабораторных животных между центрами, так как транспортировать замороженные гаметы и эмбрионы обычно быстрее, чем взрослых особей; кроме того, обмен генетическими ресурсами в виде замороженных эмбрионов позволяет избежать потенциальной передачи заболеваний и других проблем, которые связанных со здоровьем животных (Mahabir et al., 2008; Shek, 2008). Таким образом, криобанк дает исследователям практически неограниченный доступ к уникальным биомедицинским моделям, полученным в различных странах (FIMRe, 2006; Agca, 2012).
В настоящее время, возрастают требования к исследованиям, проводимым на лабораторных животных (Festing et al., 1998). Чтобы соответствовать этим стандартам, все чаще исследования проводят на животных SPF-статуса (specified pathogens free), что позволяет получать более точные данные, без ошибок связанных с патогенной нагрузкой на лабораторных животных (Shek, 2008; Брусенцев и др., 2011). Криобанк в сочетании с программой редеривации, позволяет работать с животными SPF-статуса и контролируемого генетического качества (Rall et al., 2000; Брусенцев и др., 2011; Амстиславский и др., 2013). В следующем разделе проанализированы криобиологические основы замораживания и криокон-сервации биологических объектов, прежде всего зародышей и гамет млекопитающих.
КЛЮЧЕВЫЕ АСПЕКТЫ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И КРИОКОНСЕРВАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Биологический материал может храниться при температуре — 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.