БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2012, том 38, № 2, с. 93-103
^= Обзор
УДК 57.043:574.5+576 БИОТЕХНОЛОГИЯ, БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
КРИОСОХРАНЕНИЕ КЛЕТОК И ЛИЧИНОК МОРСКИХ
ГИДРОБИОНТОВ1
© 2012 г. Н. А. Одинцова1' 2, А. В. Борода1' 2
'Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток 690059;
2Дальневосточный федеральный университет, Владивосток 690950 e-mail: nelodin@mail.ru
Статья принята к печати 6.10.2011 г.
Рассмотрены собственные и литературные данные о криоустойчивости клеток морских гидробионтов. Технология криосохранения этих объектов включает подбор условий замораживания и использование не только традиционных криопротекторов, но и комбинации экзогенных липидов, антиоксидантов и дисахарида трегалозы как стабилизатора мембран. Для сохранения клеток морских беспозвоночных нами предложен подход, основанный на использовании биологически активных веществ из тканей морских организмов. Установлен синергизм действия этих компонентов криозащитных смесей, но обнаружена видоспецифичность действия антиоксидантов. Проведен анализ факторов, определяющих выбор криопротекторов для разных типов клеток. Разработка методов криокон-сервации морских организмов открывает перспективу их широкого применения как в биологии развития, так и в морской биотехнологии и служит важной предпосылкой создания криобанков.
Ключевые слова: криоконсервация, криопротекторы, гидробионты, морские беспозвоночные, микроводоросли.
Cryopreservation of cells and larvae of marine organisms. N. A. Odintsova1-2, A. V. Boroda1-2 ('A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059; 2Far Eastern Federal University, Vladivostok 690950)
This paper reviews original and literature data on the cryoresistance of cells of marine organisms. The technology of cryopreservation of these objects includes the selection of freezing-thawing conditions and the use of not only traditional cryoprotectors, but also a combination of exogenous lipids, antioxidants, and trehalose disaccharide as a membrane stabilizing molecule. We have proposed an approach to marine invertebrate cell preservation that is based on the use of biologically active substances from tissues of marine organisms. Our results have demonstrated synergistic activity of these components of cryoprotective medium and, at the same time, a specificity of antioxidant effects. The factors determining the choice of cryoprotectors for various cell types are analyzed. The development of cryopreservation methods for marine organisms shows promise for their use in marine biotechnology and developmental biology and provides an important prerequisite for the creation of cryobanks. (Biologiya Morya, 2012, vol. 38, no. 2, pp. 93-103).
Key words: cryopreservation, cryoprotectors, marine invertebrates, microalgae.
Криоконсервация зародышевых клеток и эмбрионов - один из перспективных способов сохранения генофонда промысловых, а также редких и исчезающих видов животных и растений. Актуальность развития методов криоконсервации клеток морских гидробионтов определяется необходимостью сохранения их генофонда в условиях усиливающегося антропогенного воздействия на Мировой океан. Кроме того, криоконсервация позволяет получать материал для сравнительных экспериментальных исследований в течение всего года и обеспечивать при этом стандартизованную систему.
Главный эффект пониженных температур связан с ингибированием химических и физических процессов, что является основой для длительного сохранения клеток, тканей и органов. При температуре жидкого азота
1 Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума
Программы ДВФУ (№ 11G34.31.0010).
происходит "замораживание биологического времени" (Benson, 2008).
Случайное открытие криозащитных свойств глицерина - ключевое событие для современной криоконсервации (Polge et al., 1949). Позже были обнаружены другие вещества, обладающие подобными защитными свойствами и проникающие через мембраны клеток, среди них чаще всего применяются диметилсульфоксид (ДМСО), метанол и этиленгликоль. Обычно используют концентрации криопротекторов от 5 до 15%, однако при положительных температурах при концентрациях выше 0.05% эти вещества оказывают токсическое действие на клетки. Так, ДМСО влияет на транспорт ионов, активность пероксидаз и каталаз, а этиленгликоль и полиэти-ленгликоль значительно уменьшают полярность водной фазы, изменяя поток гидрофобных молекул между кле-
ДВО РАН (№ 12-I-0-06-015, № 09-II-C0-06-001, № 12-I-0-02-027) и
точной мембраной и внешней средой (Leung, 1991; Day, Brand, 2005). Кроме проникающих криопротекторов значительно стабилизируют мембраны клеток при замораживании-оттаивании непроникающие криопротекторы, такие как сахара (чаще всего используют сахарозу и тре-галозу), антифризные белки и экзогенные липиды.
К настоящему времени получены обширные данные о сохранении живых органелл, клеток, тканей, органов и целых организмов при сверхнизких температурах в течение длительного периода времени. Криоконсервацию широко используют для хранения спермы и эмбрионов млекопитающих, но исследований по криосохранению клеток морских гидробионтов немного. Для того, чтобы криоконсервация стала важной составной частью аква-культуры, необходимо оптимизировать методы замораживания-оттаивания как для каждого вида животных и растений, так и для разных типов клеток. Проведены исследования по замораживанию клеток микро- и макроводорослей, принадлежащих к 6 отделам (Chlorophyta, Cryptophyta, Euglenophyta, Haptophyta, Heterokontophyta, Rhodophyta), клеток и тканей морских беспозвоночных животных, принадлежащих к 6 различным типам (Arthropoda, Cnidaria, Echinodermata, Mollusca, Porifera, Urochordata), а также сперматозоидов морских рыб и млекопитающих. Цель данного обзора - оценить эффективность разработанных к настоящему времени методов криосохранения морских организмов и проанализировать воздействие основных факторов, влияющих на кри-оустойчивость клеток гидробионтов.
Устойчивость морских организмов к низким температурам
Точка замерзания морской воды -1.91°C (при солености 35%о), однако некоторые виды усоногих раков, двустворчатых и брюхоногих моллюсков (морские желуди, мидии, модиолусы, литорины) способны выживать на супра- и эулиторали, где температура воды снижается до -10... -20°C (Theede et al., 1976). Без каких-либо фатальных последствий эти животные могут находиться во льду в течение нескольких дней и даже недель (Kanwisher, 1955). Более того, в зимние месяцы иногда дважды в день происходит несколько циклов замораживания-оттаивания (Storey, 1990). Типичные криопротек-торы, обнаруженные у наземных животных, устойчивых к замерзанию (Lee, Lee, 1992), в тканях литоральных животных либо отсутствуют, либо присутствуют в незначительных количествах, что затрудняет объяснение холодо-вой устойчивости морских гидробионтов. Установлено, что физиологическая толерантность моллюска Nucella lima к охлаждению обусловлена сезонным синтезом высоких концентраций таких осмолитов, как свободные аминокислоты таурин и глицин (Stickle et al., 2010).
При охлаждении клеток важно избежать образования внутриклеточного льда или минимизировать процесс. При быстром замораживании (выше 100°С/мин) внутриклеточная вода не успевает выйти из клеток,
равновесие с внеклеточной средой нарушается и клетки переохлаждаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клеток (Mazur, 1990). При медленном замораживании (менее 0.1°С/мин) клетки теряют много воды, а это ведет к сжатию и лизису клеток. Поэтому для успешной криоконсервации необходим баланс между двумя негативными факторами: образованием внутриклеточного льда и осмотическими эффектами (Hazel, 1995).
При снижении температуры окружающей среды в тканях живых организмов могут активироваться экскреция воды, синтез и накопление анти-фризных белков, полигидроксиспиртов, сахаров и мембранных липидов с ненасыщенными жирными кислотами. Жидкокристаллическое состояние мембранных липидов способствует увеличению стабильности липидного матрикса клеток при замораживании-оттаивании (Watson, 1981). В тканях некоторых литоральных животных без летальных последствий для них может замерзать до 64% воды (Kanwisher, 1955; Storey, 1990). В мидиях около 20% связанной воды не участвует в осмотических процессах при замораживании. Путь, с помощью которого эта связанная в тканях вода становится осмотически неактивной, неизвестен, однако в гемолимфе мидий содержатся низкомолекулярные вещества, защищающие фосфолипидные везикулы от слияния и разрушения (Loomis et al., 1988). Кроме того, в тканях мидий и некоторых антарктических глубоководных рыб обнаружены антифризные гликопротеи-ны, предотвращающие образование льда (Theede et al., 1976; De Vries, 1988). В составе антифризных белков и гликопептидов много гидрофильных аминокислот, связывающих свободные молекулы воды внутри клетки и замедляющих рост кристаллов воды при понижении температуры и рекристаллизацию воды при ее повышении (Arav et al., 1994; Андреев, Петропавлов, 1996). Полигидроксиспирты и сахара стабилизируют мембранные белки и ферменты (Storey, Storey, 1991), препятствуя их денатурации и обезвоживанию за счет удержания воды в незамерзшем состоянии. В экспериментах на усо-ногом раке Balanus balanoides (Crustacea) (Loomis, 1995) и асцидии Halocynthia aurantium (Tunicates) (Sanina, Kostetsky, 2001) было установлено, что изменение холо-довой устойчивости этих животных может коррелировать с изменением состава фосфолипидов мембран.
Криоконсервация одноклеточных водорослей
Начиная с 60-х годов прошлого века, резко возрос интерес к криоконсервации разных групп водорослей (Morris, 1986; Day, 1998; Taylor, Fletcher, 1999; Day, Brand, 2005; Benson, 2008; Day et al., 2008). Это связано с необходимостью длительного сохранения коллекций культур водорослей, которые подвергаются значительным изменениям в процессе субкультивирования, а также с нуждами марикультуры водорослей. Например, в работе Родеса с коллегами (Rhodes et al., 2006) пред-
ставлены результаты успешного криосохр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.