научная статья по теме КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 ИЗ АРХЕИ METHANOCOCCUS JANNASHII Химия

Текст научной статьи на тему «КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 ИЗ АРХЕИ METHANOCOCCUS JANNASHII»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 3, с. 438-442

СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

УДК 577.322.63

КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 ИЗ АРХЕИ Methanococcus jannashii

© 2014 г. А. В. Сарских, А. Г. Габдулхаков, О. С. Костарева, А. А. Шкляева, С. В. Тищенко

Институт белка РАН, Пущино

E-mail: sveta@vega.protres.ru Поступила в редакцию 18.07.2013 г.

Кристаллическая структура мутантной формы рибосомного белка L1 из археи Methanococcus jann-aschii с делецией неконсервативного положительно заряженного кластера из восьми С-концевых аминокислотных остатков определена методом молекулярного замещения при разрешении 1.75 А. Показано, что данная мутация приводит к получению более стабильных и упорядоченных кристаллов, принадлежащих к иной, чем кристаллы белка дикого типа, пространственной группе. С-кон-цевой положительно заряженный участок незначительно влияет на взаимодействие молекул белка L1 и РНК, поэтому данную мутантную форму можно использовать для получения РНК-белковых комплексов и их кристаллизации.

DOI: 10.7868/S0023476114030175

ВВЕДЕНИЕ

Рибосомный белок L1 независимо и специфически взаимодействует с 23S рРНК и является компонентом бокового выступа рибосомы [1]. Кроме того, белок L1 может выполнять роль белка-регулятора в бактериях и археях, связываясь со своей собственной мРНК [2, 3]. Так, в E. coli этот белок регулирует собственный синтез и синтез белка L11, а в археях — синтез белков L1, L10 и L12.

Ранее были определены кристаллические структуры белка L1 в свободном состоянии и в комплексах со специфическими фрагментами 23SрРНК или мРНК для бактерий Thermus ther-mophilus (TthL1) [4—7], Aquifex aeolicus (AaeL1) [8] и архей Methanococcus thermolithotrophicus (MthL1) [9], Sulfolobus acidocaldarius (SacL1) и Methanococcus jannaschii (MjaL1) [10, 11]. Для достоверного анализа РНК-белковых взаимодействий необходимо получать структуры гомологических комплексов из одного и того же организма с высоким разрешением. В настоящее время имеется лишь одна такая структура — из бактерии T. thermophilus [7]. В рамках работы по определению структур гомологических РНК-белковых комплексов архей-ных рибосомных белков ведется оптимизация условий получения кристаллов.

MjaL1 имеет высокую скорость взаимодействия с РНК и образует наиболее прочный комплекс по сравнению с белком L1 из других организмов (табл. 1). На С-конце MjaL1 имеется неконсервативный кластер, содержащий шесть аминокислотных остатков лизина. Данный участок не виден в структуре MjaL1 как в свободном состоянии [11], так и в комплексе с мРНК [5]. По-

лучена и закристаллизована мутантная форма белка Ь1 (MjaL1-8C), лишенная восьми С-конце-вых аминокислотных остатков (ККЕКАККК). Кристаллы М]аЬ1-8С отличаются повышенной стабильностью и упорядоченностью. В настоящей работе представлено описание и сравнительный анализ структуры М]аЬ1-8С, показано, что вклад неконсервативного положительно заряженного участка молекулы белка М]аЬ1 во взаимодействие с РНК незначителен, и данная форма может быть использована для кристаллизации комплексов со специфическими фрагментами РНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Конструирование плазмиды. Ген мутантного белка MjaL1-8C получен методом ПЦР, в реакции использовались праймеры 5'-GGGGAATTGC-GAGCGGATAACAATTCC-3' (прямой праймер) и 5' - CTTATCATCGATAAGCTTTAAACCTTTA-CAGCAGGACCC-3' (обратный праймер). Ген белка MjaL1-8C клонировался в вектор pET11a-PL по сайтам эндонуклеаз рестрикции XbaI и HindIII. Нуклеотидная последовательность клонированного гена проверялась секвенированием.

Выделение белка. Экспрессию гена MjaL1-8C проводили в клетках Escherichia coli BL21(DE3) с использованием системы Штудиера [13]. После индукции экспрессии с помощью изопропил-Р-D-тиогалактозида (ИПТГ) клетки осаждали и разрушали ультразвуком. Выделение мутантной формы MjaL1-8C проводили по схеме [11] с небольшими модификациями. РНК-связывающие свойства мутантной формы проверялись методом

Таблица 1. Кинетические параметры формирования комплексов между рибосомным белком Ь1 из бактерий и архей и специфическим фрагментом мРНК

Белок/температура роста Константа скорости ассоциации ka (1 х 104/(Моль с)) Константа скорости диссоциации kd (1 х 10-4/с) Равновесная константа диссоциации KD (Моль-9)

TthL1 /75 °С 0.4 4.. 47

AaeL1/95°C 0.9 20.5 218.0

MthL1/65°C 5.5 59.5 108.0

SacL1/80°C 88.. 63.1 7.2

MjaL1/85°C 278.0 12.0 0.4

MjaL1-8C/85°C 151.0 12.2 0.8

гель-шифта. Были использованы 5'-концевой фрагмент мРНК белка L1 M. jannaschii длиной 48 нуклеотидов и специфический фрагмент 23 S рРНК M. jannaschii длиной 61 нуклеотид.

Кинетический анализ взаимодействия белка MjaL1-8C со специфическим фрагментом мРНК проводился методом поверхностного плазмонно-го резонанса (ППР) [14] с использованием системы ProteOn XPR36 (Bio-Rad, USA). Биотинили-рованные молекулы мРНК M. jannaschii длиной 48 нуклеотидов наносили на сенсорные чипы с иммобилизованым авидином (NLS, Bio-Rad) [15]. Кинетический анализ проводили в буфере, содержащем 30 мМ Tris-HCl, pH25°c 7.5, 500 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 0.005% твин-20. Результаты измерений обрабатывались с помощью программы BIAevaluation, в качестве теоретической модели использовалась простая бимолекулярная модель (1:1).

Кристаллизация. Для экспериментов по кристаллизации белок диализом был переведен в буфер, содержащий 30 мМ Tris-HCl, pH25°c 7.5, 60 мМ KCl. Кристаллизацию белка MjaL1-8C проводили методом диффузии паров в висящей капле — 1.5 мкл раствора белка смешивали с 1.5 мкл раствора № 41 Crystal Screen™, Hampton Research, содержащего 20% ПЭГ 4K, 10% v/v изо-пропанола, 0.1 М Hepes-NaOH, рН 7.5, 0.5 мкл 0.8 М KNa-тартрат. Капли уравновешивали против того же раствора при температуре 4°С. Кристаллы появлялись на третьи сутки и достигали максимальных размеров (400 х 100 х 50 мкм) через неделю. Перед замораживанием в жидком азоте кристаллы переносили в криораствор, содержащий 33% ПЭГ4К, 0.1 М Hepes-NaOH, рН 7.5.

Сбор и обработка дифракционных данных. Дифракционные данные были собраны от одного кристалла на лабораторной рентгеновской установке, состоящей из генератора с вращающимся анодом Proteum X8, снабженного фокусирующей системой Montel 200, и CCD-детектора (фирма Bruker). При съемке данных напряжение генератора составляло 45 кВ, сила тока 40 мА, диаметр пучка 0.2 мм, расстояние кристалл—детектор

45 мм, угол осцилляции равен 0.5°. Набор обработан в программном комплексе Рго1еит 2 (www.bruker.com). Характеристика дифракционных данных приведена в табл. 2. Кристаллы белка

Таблица 2. Статистические характеристики дифракционного набора и кристаллографического уточнения рибосомного белка М]аЬ1-8С

Пр. гр. P2l (№4)

а, Ь, с, А 33.87, 105.25, 38.53

а, в, у, град 90.00, 104.01, 90.00

Длина волны, А 1.54

Пределы разрешения, А 32.86-1.75 (1.85-1.75)

Общее число отражений 69416 (6100)

Число уникальных отражений 26074(3766)

Полнота набора данных, % 98.8 (93.4)

Вте^е, % 5.7 (42.2)

Повторяемость рефлексов 2.63 (1.62)

Среднее значение //8(7) 15.. (2.53)

Диапазон разрешения, А 32.86-1.75 (1.78-1.75)

Число молекул в асимметрич- 1

ной части

Число отражений 26039 (2365)

Размер тестовой выборки, % 5

Ксу!, % 16.4 (29.2)

Rfi.ee, % 22.0 (34.1)

Средний температурный 18.5

фактор, А2

Среднеквадратичные откло-

нения:

Длины связей, А 0.006

Валентные углы, град 1.051

Число остатков на карте

Рамачандрана

Наиболее предпочтительные 94.6

районы, %

Дополнительно разрешенные 5.4

районы, %

Примечание. Данные в скобках соответствуют интервалу наиболее высокого разрешения.

440

САРСКИХ и др.

Рис. 1. Фрагмент карты электронной плотности в области связывания тартрата, длины связей указаны в ангстремах, для аминокислотных остатков из симметричных молекул в скобках указаны элементы трансляции.

MjaL1-8C принадлежат к пр. гр. P21, предел разрешения дифракционных отражений 1.75 А. Значение коэффициента Метьюза (Vm) попадает в разрешенную область в предположении, что в асимметричной части ячейки находится одна молекула белка (211 аминокислотных остатков). В этом случае Vm = 2.80 А3/Да, содержание растворителя составляет 56.05%.

Определение пространственной структуры белка. Структура белка решена методом молекулярного замещения с использованием программы PHASER [13]. В качестве стартовой модели использовалась модель структуры рибосомного белка L1 из M. jannaschii дикого типа (PDB ID 1I2A). Значения LLG и Z-score (стандартное отклонение данного решения от среднего значения) после выполнения функции вращения составили 87.8 и 6.1 соответственно, а после функции трансляции — 203.7 и 12.2, что свидетельствует о правильности решения. Начальная модель подвергалась нескольким циклам ручной правки и кристаллографического уточнения с помощью программ COOT [16] и REFMAC [17], а окончательное уточнение было проведено в программе PHENIX [17]. Статистика уточнения приведена в табл. 2. Карты электронной плотности получились отличного качества, включая области, соответствующие концевым участкам (фрагмент карты электронной плотности представлен на рис. 1), что позволило построить аминокислотные остатки всей полипептидной цепи.

Окончательная модель, уточненная до Rciyst = = 16.4% и Rfree = 22.0% при разрешении 1.75 А, содержит 211 аминокислотных остатков, 219 моле-

кул воды, одну молекулу тартрата, одну молекулу изопропанола и три иона хлора. Полученная модель обладает хорошими стереохимическими параметрами и не содержит аминокислотных остатков, лежащих в запрещенных областях карты Ра-мачандрана [19, 20]. Координаты модели депонированы в банк белковых структур (Protein Data Bank, ID 4LQ4).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетический анализ взаимодействий белка L1 из двух бактерий и трех архей со специфическим фрагментом мРНК M. vannielli (табл. 1) показал, что MjaL1 обладает максимальным сродством к мРНК, причем константа скорости ассоциации комплекса MjaL1-мРНК очень высока. В отличие от данных [21] в настоящей работе не наблюдается зависимости между стабильностью РНК-белковых взаимодействий и термальной устойчивостью микроорганизмов. MjaL1

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»