КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2011, том 56, № 4, с. 648-652
СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
УДК 577.322.63
Посвящается памяти Б.К. Вайнштейна
КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1
ИЗ БАКТЕРИИ Aquifex aeolicus
© 2011 г. Е. Ю. Никонова, С. В. Тищенко, А. Г. Габдулхаков, А. А. Шкляева, М. Б. Гарбер, С. В. Никонов, Н. А. Невская
Институт белка РАН, Пущино
E-mail: nevskaya@protres.ru Поступила в редакцию 24.02.2011 г.
Кристаллическая структура рибосомного белка L1 из бактерии Aquifex aeolicus определена методом молекулярного замещения и уточнена до Rcryst = 19.4, Rfree = 25.1% при разрешении 2.1 А. Белок состоит из двух доменов, соединенных гибкой перетяжкой. В полученной структуре домены сближены и образуют "закрытую" конформацию. Ранее такая конформация была обнаружена в структуре белка L1 из бактерии Thermus thermophilus, тогда как структуры архейных белков L1 и структуры всех белков L1 в РНК-связанном состоянии имеют "открытую" конформацию. Наличие "закрытой" конформации в структурах двух белков L1, кристаллизующихся в разных пространственных группах и принадлежащих разным бактериям, позволяет утверждать, что эта конформация является особенностью бактериальных белков L1 в свободном состоянии.
ВВЕДЕНИЕ
Рибосомный белок L1 независимо и специфически взаимодействует с 23S рРНК и является частью бокового выступа большой субчастицы рибосомы [1]. Этот белок обладает также второй функцией и способен выступать в роли белка-регулятора в бактериях и археях, связываясь со своей собственной мРНК [2, 3]. Так, в E. coli этот белок регулирует собственный синтез и синтез белка L11, а в археях — синтез белков L1, L10 и L12.
Кристаллические структуры с атомным разрешением белка L1 в свободном состоянии и в комплексах со специфическими фрагментами 23 S рРНК или мРНК определены для одной из бактерий Thermus thermophilus (TthL1) [4—6] и нескольких архей: Methanococcus jannaschii (MjaL1) [7, 8], Methanococcus thermolithotrophicus (MthL1) [9] и Sulfolobus acidocaldarius (SacL1) [10]. Кроме того, недавно была определена структура белка L1 из T. thermophilus в составе рибосомы [11].
Белок L1 состоит из двух доменов, соединенных между собой гибкой перетяжкой, которая позволяет доменам изменять свое взаимное расположение. Все определенные структуры архейных белков L1 имеют так называемую "открытую конформацию", в которой взаимное положение доменов таково, что РНК-связывающие участки оказываются доступными для молекул РНК. Иначе обстоит дело с бактериальным белком TthL1. В свободном состоянии он имеет "закрытую" конформацию, в которой домены сближены, и РНК-связывающие участки оказываются
недоступными для молекул РНК. В комплексах с фрагментами рРНК или мРНК этот белок имеет "открытую" конформацию, аналогичную той, что обнаруживается в архейных белках Ь1.
Для того чтобы выяснить, является ли такое поведение особенностью только ИЬЫ или оно свойственно и другим бактериальным белкам Ы, была определена пространственная структура Ь1 из гипертермофильной бактерии Aquifex аеоЫст (AaeL1) в свободном состоянии. В данной статье описана структура этого белка при разрешении 2.1 А и проведено ее сравнение со структурой белка ТЬЫ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Конструирование плазмиды. Ген белка AaeLl из AaeLl клонирован в экспрессионный вектор pETlla-PL. Матрицей для ПЦР была геномная ДНК A. aeolicus. Для ПЦР были использованы праймеры: 5'GGAATTCCATATGGCTAGAAGGGGTAAAAA ATACATAGAAGCTTC3' (прямой) и 5'CAATATGA ATTCTTACGCAGCCTTTTCTTGAAGTTTCTTT AGAAC3' (обратный), несущие сайты для эндо-нуклеаз рестрикции FauNDI и EcoRI соответственно. Нуклеотидная последовательность клонированного гена проверена секвенированием.
Выделение белка. Ген белка AaeLl был экс-прессирован в штамме-суперпродуценте Escherichia coli BL2l(DE3)/pETlla-PL-AaeLl. Клетки штамма-суперпродуцента растили при температуре 37°С при интенсивном перемешивании на
КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1
649
среде LB до оптической плотности OD590 = 0.5 ОЕ. Для активации Т7 РНК-полимеразы в среду добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0.5 мМ. После добавления индуктора клетки инкубировались в тех же условиях еще в течение 3 ч.
Разрушение клеток проводили в лизирующем буфере (90 мМ TOs-HCl (рН25°С 7.5), 800 мМ NaCl,
I мМ Ш2ЭДГА, 50 мМ MgCl2, 15 мМ ß-меркапто-этанол, 0.1 мМ PMSF) на ультразвуковом дезинтеграторе Sonic Dismembrator 550 (Fisher Scientific, США). Из супернатанта низкоскоростным центрифугированием удаляли обломки клеточных стенок, а затем с помощью высокоскоростного центрифугирования удаляли рибосомы. Супер-натант прогревали при 65°С в течение 15 мин. Денатурированные термолабильные белки E. coli осаждали низкоскоростным центрифугированием. Перед ионообменной хроматографией препарат разводили буфером 50 мМ NaAc, pH 5.5 до конечной концентрации NaCl — 150 мМ. Образец наносили на колонку СМ-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером 50 мМ Na-аце-тат, pH 5.5, 150 мМ NaCl. Элюцию белка проводили линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0.1 до 1 М в буфере 50 мМ Na-ацетат, pH 5.5. Фракции, содержащие белок, объединяли и диализовали против буфера 50 мМ Tris-HCl, pH25°c: 8.0, 100 мМ NaCl. Вторым этапом очистки белка была аффинная хроматография на Heparin-Sepharose. Образец белка наносили на колонку Heparin-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером 50 мМ Tris-HCl, pH25°c: 8.0, 100 мМ NaCl. Элюцию белка проводили линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0.1 до 1 М в буфере 50 мМ Tris HCl, pH^ 8.0. Фракции, содержащие белок AaeL1, объединяли. Белок, отдиализованный в буфер 20 мМ Tris-HCl, pH25°C 7.5, 60 мМ KCl, концентрировали до
II мг/мл на ультрафильтрах (Centricon10).
Кристаллизация. Раствор белка смешивали с
раствором № 20 Crystal Screen™, Hampton Research (25% ПЭГ 4К, 100 мМ Na-ацетатного буфера, рН 4.6, 200 мМ сульфата аммония) в соотношении 1:1. Висящие капли объемом 4 мкл уравновешивали против того же раствора диффузией паров при температуре 12°С. Кристаллы в форме пластинок появлялись в каплях через 3—4 дня, через неделю они достигали размеров 800 х 100 х 30 мкм. Перед замораживанием в жидком азоте кристаллы переносили в криораствор, содержащий 30% ПЭГ 4К, 100 мМ Na-ацетатного буфера, рН 4.6 и 200 мМ сульфата аммония.
Сбор и обработка дифракционных данных. Дифракционные данные были собраны от одного кристалла на лабораторной рентгеновской установке, состоящей из генератора с вращающимся анодом Proteum X8, снабженного фокусирующей системой Montel 200 (фирма Bruker) и двумерного
Статистические характеристики дифракционного набора и кристаллографического уточнения рибосомно-го белка АаеЬ1
Статистика набора
Пространственная группа
Параметры ячейки, А, град
Длина волны, А
Пределы разрешения, А
Общее число отражений
Число уникальных отражений
Полнота, %
R %
Rmerge, %
Избыточность Среднее I/a(I) Мозаичность, град
C2
a = 107.5, b = 37.5, с = 59.0, а = у = 90.0, ß = 110.3
I.54
28.67-2.1 (2.2-2.1) 41540 (1933) 12221 (1411)
92.9 (83.3) 9.8 (28.9) 3.39 (1.36)
II.94 (2.85) 0.37
Статистика уточнения
Диапазон разрешения, А 28.7-2.1 (2.31-2.10)
Число молекул в асимметричной части 1
Число отражений 12219 (611)
Размер тестовой выборки, % 5
В-а^, % 19.4 (21.9)
Rfi.ee, % 25.1 (29.4)
Средний температурный фактор, А2 17.1
Среднеквадратичные отклонения
Длины связей, А 0.008
Валентные углы, А 1.146
Число остатков на карте Рамачандрана
Наиболее предпочтительные районы, % 93.4
Дополнительно разрешенные районы, % 6.6
Примечание. Данные в скобках соответствуют интервалу наиболее высокого разрешения.
детектора МАЯ-345 (фирма МагКезеагсИ, Германия). При съемке данных напряжение генератора составляло 45 кВ, сила тока 40 мА, диаметр пучка 0.2 мм, расстояние кристалл-детектор 120 мм, угол осцилляции равен 0.75°. Набор обработан в программном комплексе XDS [12]. Характеристика дифракционных данных приведена в таблице. Кристаллы белка Ь1 из А. aeolicus принадлежат к пр. гр. С2 и отражают до 2. 1 А. Значение коэффициента Метьюза (Ут) попадает в разрешенную область
650
CT
al
D
НИКОНОВА и др
Q a2
l0 20 30 40 50 60
Лл.. xaaaa : aa'vllaaa.lijviafa.iaa,^ 6l
Ttii -■'"■■г^ДАлТ.ч-к^г.л --АКГАА^гумаупаагпр-Г^ПОХ- 57
12»
T> (;
l00
a4
J
70 80 90 l00 ll0 l20
l23
- -1, v a i-; T v: ■:. a 11 -,: ■; а ■,:■ vf. v: .л т а -; а к т к а а. аа .v; а vv;;;а а т т с к * *, г.1; wat^ia awat ll8
СЕ
a5
J
l30
l40
ТО»
l50
О a6
Lß7^> I l70
l60 l70 l80
l85 l8l
a7 ) I-ß9-^ LgT^ w a8
190 200 210 220 230 240
Л ■ 1 КАК L1 AK L AAA. IL-AWKAK А А А А А ■ А А А К АМА V A LTAAAA:' V A L D I N L V L К К Lg L А А А 242
т i.; i к LKLAA: кA AA А.A-ALLA А к A L А а А ■ AA К LA./AZ A vaaaxa; AA: y а A n p А s 228
Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей рибосомных белков L1 из A. aeolicus (AaeLl) и T. thermophilus (TthLl). Стрелками обозначены ß-тяжи, цилиндрами а-спирали.
в предположении, что в асимметричной части ячейки находится одна молекула белка (242 аминокислотных остатка). В этом случае Vm = 1.99 А3/Да, содержание растворителя составляет 37.59%.
Определение пространственной структуры белка. Структура белка решена методом молекулярного замещения с использованием программы PHASER [13]. В качестве стартовой модели использована модель структуры рибосомного белка L1 из Thermus thermophilus (PDB ID 1AD2). Степень идентичности аминокислотных последовательностей этих белков составляет 49.6%. Вначале был проведен поиск полной модели, но результатов он не дал, были получены отрицательные значения LLG (log-likelihood gain). Для оптимизации поиска стартовая модель была разбита на два домена, и определение их положений проводилось последовательно. Значения LLG и Z-score (стандартное отклонение данного решения от среднего значения) после идентификации положения первого домена составили 36.3 и 8.68 соответственно. После определения позиции второго домена соответствующие величины приняли значения 109.76 и 13.11, что является показателями правильности решения. Начальная модель подверглась нескольким циклам ручной правки и крис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.