научная статья по теме КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 ИЗ БАКТЕРИИ AQUIFEX AEOLICUS Химия

Текст научной статьи на тему «КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 ИЗ БАКТЕРИИ AQUIFEX AEOLICUS»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2011, том 56, № 4, с. 648-652

СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

УДК 577.322.63

Посвящается памяти Б.К. Вайнштейна

КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1

ИЗ БАКТЕРИИ Aquifex aeolicus

© 2011 г. Е. Ю. Никонова, С. В. Тищенко, А. Г. Габдулхаков, А. А. Шкляева, М. Б. Гарбер, С. В. Никонов, Н. А. Невская

Институт белка РАН, Пущино

E-mail: nevskaya@protres.ru Поступила в редакцию 24.02.2011 г.

Кристаллическая структура рибосомного белка L1 из бактерии Aquifex aeolicus определена методом молекулярного замещения и уточнена до Rcryst = 19.4, Rfree = 25.1% при разрешении 2.1 А. Белок состоит из двух доменов, соединенных гибкой перетяжкой. В полученной структуре домены сближены и образуют "закрытую" конформацию. Ранее такая конформация была обнаружена в структуре белка L1 из бактерии Thermus thermophilus, тогда как структуры архейных белков L1 и структуры всех белков L1 в РНК-связанном состоянии имеют "открытую" конформацию. Наличие "закрытой" конформации в структурах двух белков L1, кристаллизующихся в разных пространственных группах и принадлежащих разным бактериям, позволяет утверждать, что эта конформация является особенностью бактериальных белков L1 в свободном состоянии.

ВВЕДЕНИЕ

Рибосомный белок L1 независимо и специфически взаимодействует с 23S рРНК и является частью бокового выступа большой субчастицы рибосомы [1]. Этот белок обладает также второй функцией и способен выступать в роли белка-регулятора в бактериях и археях, связываясь со своей собственной мРНК [2, 3]. Так, в E. coli этот белок регулирует собственный синтез и синтез белка L11, а в археях — синтез белков L1, L10 и L12.

Кристаллические структуры с атомным разрешением белка L1 в свободном состоянии и в комплексах со специфическими фрагментами 23 S рРНК или мРНК определены для одной из бактерий Thermus thermophilus (TthL1) [4—6] и нескольких архей: Methanococcus jannaschii (MjaL1) [7, 8], Methanococcus thermolithotrophicus (MthL1) [9] и Sulfolobus acidocaldarius (SacL1) [10]. Кроме того, недавно была определена структура белка L1 из T. thermophilus в составе рибосомы [11].

Белок L1 состоит из двух доменов, соединенных между собой гибкой перетяжкой, которая позволяет доменам изменять свое взаимное расположение. Все определенные структуры архейных белков L1 имеют так называемую "открытую конформацию", в которой взаимное положение доменов таково, что РНК-связывающие участки оказываются доступными для молекул РНК. Иначе обстоит дело с бактериальным белком TthL1. В свободном состоянии он имеет "закрытую" конформацию, в которой домены сближены, и РНК-связывающие участки оказываются

недоступными для молекул РНК. В комплексах с фрагментами рРНК или мРНК этот белок имеет "открытую" конформацию, аналогичную той, что обнаруживается в архейных белках Ь1.

Для того чтобы выяснить, является ли такое поведение особенностью только ИЬЫ или оно свойственно и другим бактериальным белкам Ы, была определена пространственная структура Ь1 из гипертермофильной бактерии Aquifex аеоЫст (AaeL1) в свободном состоянии. В данной статье описана структура этого белка при разрешении 2.1 А и проведено ее сравнение со структурой белка ТЬЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Конструирование плазмиды. Ген белка AaeLl из AaeLl клонирован в экспрессионный вектор pETlla-PL. Матрицей для ПЦР была геномная ДНК A. aeolicus. Для ПЦР были использованы праймеры: 5'GGAATTCCATATGGCTAGAAGGGGTAAAAA ATACATAGAAGCTTC3' (прямой) и 5'CAATATGA ATTCTTACGCAGCCTTTTCTTGAAGTTTCTTT AGAAC3' (обратный), несущие сайты для эндо-нуклеаз рестрикции FauNDI и EcoRI соответственно. Нуклеотидная последовательность клонированного гена проверена секвенированием.

Выделение белка. Ген белка AaeLl был экс-прессирован в штамме-суперпродуценте Escherichia coli BL2l(DE3)/pETlla-PL-AaeLl. Клетки штамма-суперпродуцента растили при температуре 37°С при интенсивном перемешивании на

КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1

649

среде LB до оптической плотности OD590 = 0.5 ОЕ. Для активации Т7 РНК-полимеразы в среду добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0.5 мМ. После добавления индуктора клетки инкубировались в тех же условиях еще в течение 3 ч.

Разрушение клеток проводили в лизирующем буфере (90 мМ TOs-HCl (рН25°С 7.5), 800 мМ NaCl,

I мМ Ш2ЭДГА, 50 мМ MgCl2, 15 мМ ß-меркапто-этанол, 0.1 мМ PMSF) на ультразвуковом дезинтеграторе Sonic Dismembrator 550 (Fisher Scientific, США). Из супернатанта низкоскоростным центрифугированием удаляли обломки клеточных стенок, а затем с помощью высокоскоростного центрифугирования удаляли рибосомы. Супер-натант прогревали при 65°С в течение 15 мин. Денатурированные термолабильные белки E. coli осаждали низкоскоростным центрифугированием. Перед ионообменной хроматографией препарат разводили буфером 50 мМ NaAc, pH 5.5 до конечной концентрации NaCl — 150 мМ. Образец наносили на колонку СМ-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером 50 мМ Na-аце-тат, pH 5.5, 150 мМ NaCl. Элюцию белка проводили линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0.1 до 1 М в буфере 50 мМ Na-ацетат, pH 5.5. Фракции, содержащие белок, объединяли и диализовали против буфера 50 мМ Tris-HCl, pH25°c: 8.0, 100 мМ NaCl. Вторым этапом очистки белка была аффинная хроматография на Heparin-Sepharose. Образец белка наносили на колонку Heparin-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером 50 мМ Tris-HCl, pH25°c: 8.0, 100 мМ NaCl. Элюцию белка проводили линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0.1 до 1 М в буфере 50 мМ Tris HCl, pH^ 8.0. Фракции, содержащие белок AaeL1, объединяли. Белок, отдиализованный в буфер 20 мМ Tris-HCl, pH25°C 7.5, 60 мМ KCl, концентрировали до

II мг/мл на ультрафильтрах (Centricon10).

Кристаллизация. Раствор белка смешивали с

раствором № 20 Crystal Screen™, Hampton Research (25% ПЭГ 4К, 100 мМ Na-ацетатного буфера, рН 4.6, 200 мМ сульфата аммония) в соотношении 1:1. Висящие капли объемом 4 мкл уравновешивали против того же раствора диффузией паров при температуре 12°С. Кристаллы в форме пластинок появлялись в каплях через 3—4 дня, через неделю они достигали размеров 800 х 100 х 30 мкм. Перед замораживанием в жидком азоте кристаллы переносили в криораствор, содержащий 30% ПЭГ 4К, 100 мМ Na-ацетатного буфера, рН 4.6 и 200 мМ сульфата аммония.

Сбор и обработка дифракционных данных. Дифракционные данные были собраны от одного кристалла на лабораторной рентгеновской установке, состоящей из генератора с вращающимся анодом Proteum X8, снабженного фокусирующей системой Montel 200 (фирма Bruker) и двумерного

Статистические характеристики дифракционного набора и кристаллографического уточнения рибосомно-го белка АаеЬ1

Статистика набора

Пространственная группа

Параметры ячейки, А, град

Длина волны, А

Пределы разрешения, А

Общее число отражений

Число уникальных отражений

Полнота, %

R %

Rmerge, %

Избыточность Среднее I/a(I) Мозаичность, град

C2

a = 107.5, b = 37.5, с = 59.0, а = у = 90.0, ß = 110.3

I.54

28.67-2.1 (2.2-2.1) 41540 (1933) 12221 (1411)

92.9 (83.3) 9.8 (28.9) 3.39 (1.36)

II.94 (2.85) 0.37

Статистика уточнения

Диапазон разрешения, А 28.7-2.1 (2.31-2.10)

Число молекул в асимметричной части 1

Число отражений 12219 (611)

Размер тестовой выборки, % 5

В-а^, % 19.4 (21.9)

Rfi.ee, % 25.1 (29.4)

Средний температурный фактор, А2 17.1

Среднеквадратичные отклонения

Длины связей, А 0.008

Валентные углы, А 1.146

Число остатков на карте Рамачандрана

Наиболее предпочтительные районы, % 93.4

Дополнительно разрешенные районы, % 6.6

Примечание. Данные в скобках соответствуют интервалу наиболее высокого разрешения.

детектора МАЯ-345 (фирма МагКезеагсИ, Германия). При съемке данных напряжение генератора составляло 45 кВ, сила тока 40 мА, диаметр пучка 0.2 мм, расстояние кристалл-детектор 120 мм, угол осцилляции равен 0.75°. Набор обработан в программном комплексе XDS [12]. Характеристика дифракционных данных приведена в таблице. Кристаллы белка Ь1 из А. aeolicus принадлежат к пр. гр. С2 и отражают до 2. 1 А. Значение коэффициента Метьюза (Ут) попадает в разрешенную область

650

CT

al

D

НИКОНОВА и др

Q a2

l0 20 30 40 50 60

Лл.. xaaaa : aa'vllaaa.lijviafa.iaa,^ 6l

Ttii -■'"■■г^ДАлТ.ч-к^г.л --АКГАА^гумаупаагпр-Г^ПОХ- 57

12»

T> (;

l00

a4

J

70 80 90 l00 ll0 l20

l23

- -1, v a i-; T v: ■:. a 11 -,: ■; а ■,:■ vf. v: .л т а -; а к т к а а. аа .v; а vv;;;а а т т с к * *, г.1; wat^ia awat ll8

СЕ

a5

J

l30

l40

ТО»

l50

О a6

Lß7^> I l70

l60 l70 l80

l85 l8l

a7 ) I-ß9-^ LgT^ w a8

190 200 210 220 230 240

Л ■ 1 КАК L1 AK L AAA. IL-AWKAK А А А А А ■ А А А К АМА V A LTAAAA:' V A L D I N L V L К К Lg L А А А 242

т i.; i к LKLAA: кA AA А.A-ALLA А к A L А а А ■ AA К LA./AZ A vaaaxa; AA: y а A n p А s 228

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей рибосомных белков L1 из A. aeolicus (AaeLl) и T. thermophilus (TthLl). Стрелками обозначены ß-тяжи, цилиндрами а-спирали.

в предположении, что в асимметричной части ячейки находится одна молекула белка (242 аминокислотных остатка). В этом случае Vm = 1.99 А3/Да, содержание растворителя составляет 37.59%.

Определение пространственной структуры белка. Структура белка решена методом молекулярного замещения с использованием программы PHASER [13]. В качестве стартовой модели использована модель структуры рибосомного белка L1 из Thermus thermophilus (PDB ID 1AD2). Степень идентичности аминокислотных последовательностей этих белков составляет 49.6%. Вначале был проведен поиск полной модели, но результатов он не дал, были получены отрицательные значения LLG (log-likelihood gain). Для оптимизации поиска стартовая модель была разбита на два домена, и определение их положений проводилось последовательно. Значения LLG и Z-score (стандартное отклонение данного решения от среднего значения) после идентификации положения первого домена составили 36.3 и 8.68 соответственно. После определения позиции второго домена соответствующие величины приняли значения 109.76 и 13.11, что является показателями правильности решения. Начальная модель подверглась нескольким циклам ручной правки и крис

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»