МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 4, с. 688-696
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ^^^^^^^^ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.21+577.322
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ МУТАНТНЫХ ФОРМ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1
© 2007 г. Е. Ю. Никонова1, С. А. Волчков2, В. Г. Кляшторный1, С. В. Тищенко1, О. С. Костарева1, Н. А. Невская1, О. С. Никонов1, А. Г. Габдулхаков1, А. Д. Никулин1, Н. Л. Давыдова1, 3, В. А. Стрельцов4, М. Б. Гарбер1*, С. В. Никонов1
1Институт белка Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 2Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 3Angiogenesis Laboratory, Ludwig Institute for Cancer Research, PO Box 2008, Royal Melbourne Hospital, Parkville, VIC
3050, Australia
4CSIRO Molecular & Health Technologies 343 Royal Parade Parkville VIC 3052, Australia
Поступила в редакцию 31.08.2006 г.
Принята к печати 16.11.2006 г.
Получено девять мутантых форм рибосомных белков L1 из бактерии Thermus thermophilus и археи Methanococcus jannaschii, определены и проанализированы их кристаллические структуры. Также проведен анализ определенной нами ранее структуры мутантной формы S179C TthL1. Показано, что в половине рассмотренных случаев точечные мутации аминокислотных остатков на поверхности белка приводят к существенным изменениям его пространственной структуры. Это подтверждает необходимость предварительного определения или, по крайней мере, моделирования структур мутантных форм белков для корректного исследования биологических процессов с использованием сайт-направленного мутагенеза. Детальное сопоставление структур мутантных форм белков L1 и соответствующих белков L1 дикого типа показало, что боковая группа аминокислотного остатка в точке мутации всегда стремится расположиться так же, как и боковая группа исходного остатка в белке дикого типа. Это наблюдение может помочь при моделировании структур мутантных белков.
Ключевые слова: рибосомный белок L1, сайт-направленные мутации, пространственная структура.
CRYSTAL STRUCTURES OF MUTANT RIBOSOMAL PROTEINS L1, by E. Yu. Nikonova1, S. A. Volchkov2, V. G. Kljashtorny1, S. V. Tishchenko1, O. S. Kostareva1, N. A. Nevskaya1, O. S. Nikonov1, A. G. Gabdoulkhakov1, A. D. Nikulin1, N. L. Davydova1,3, V. A. Streltsov4, M. B. Garber1*, S. V. Nikonov1 (institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia, *e-mail: garber@vega.pro-tres.ru; 2Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia; 3Angiogenesis Laboratory, Ludwig Institute for Cancer Research, PO Box 2008, Royal Melbourne Hospital, Parkville, VIC 3050, Australia; 4CSIRO Molecular & Health Technologies 343 Royal Parade Parkville VIC 3052 Australia). Nine mutant forms of ribosomal proteins L1 from the bacterium Thermus thermophilus and the archaeon Methanococcus jannaschii were obtained. Their crystal structures were determined and analyzed. Earlier determined structure of S179C TthL1 was also thoroughly analyzed. Five from ten mutant proteins reveal essential changes of spatial structure caused by surface point mutation. It proves that for correct studies of biological processes by site-directed mutagenesis it is necessary to determine or at least to model spatial structures of mutant proteins. Detailed comparison of mutant L1 structures with that of corresponding wild type proteins reveals that side chain of a mutated amino acid residue tries to locate like the side chain of the original residue in the wild type protein. This observation helps to model the mutant structures.
Key words: ribosomal protein L1, site-directed mutations, spatial structure.
Рибосомный белок L1 является частью бокового выступа большой субчастицы рибосомы. В бактерии Escherichia coli этот белок независимо и специфически взаимодействует с 23S рРНК, защищая от переваривания нуклеазами фрагмент длиной около 100 нуклеотидов [1]. Этот белок обладает также второй функцией и способен высту-
* Эл. почта: garber@vega.protres.ru
пать в роли белка-регулятора в бактериях и архе-ях [2, 3]. Так, в E. coli этот белок регулирует собственный синтез и синтез белка L11, а в археях -синтез белков L1, L10 и L12.
Экспериментально определить, чем обусловлено уменьшение примерно на порядок сродства к мРНк по сравнению с рРНК, возможно только путем исследования относительной роли тех или иных аминокислотных остатков и нуклеотидов в
связывании. Представление же об этом могут дать адресные мутации в области РНК-белкового интерфейса, приводящие к изменению сродства белка к рРНК и/или мРНК. При этом надо быть уверенными, что сделанные мутации не приводят к существенным изменениям пространственной структуры белка. Этот вопрос особенно актуален для белка L1, поскольку два домена молекулы соединены между собой гибким участком, позволяющим доменам менять взаимную ориентацию.
В настоящей статье описаны пространственные структуры девяти мутантых форм рибосом-ного белка Li из бактерии Thermus thermophilus (TthLii) и археиMethanococcus jannaschii (MjaLi). Мутациям подвергали аминокислотные остатки, расположенные на поверхности белка в области РНК-белкового интерфейса. Структуры полученных мутантных белков определены с высоким разрешением, что позволило провести их детальное сопоставление со структурами соответствующих белков дикого типа, полученными ранее [4, 5]. Также проанализирована структура мутант-ной формы TthLi, полученная нами ранее [6].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение мутантных форм белка L1. Введение аминокислотных замен в белки MjaLi и TthLi осуществлено методом сайт-направленного мутагенеза [7]. В качестве матриц для ПЦР были использованы плазмиды pMjaLi.4 и pTthL1.4, содержащие гены MjaLl и TthLi, соответственно. Сайт-специфические мутации в амплифицируемые фрагменты ДНК вводили методом ПЦР с перекрывающимися праймерами. Гены мутантных форм белков MjaLl и TthLi клонировали в экс-прессионный вектор pETlla-PL. Правильность последовательности полученной плазмиды подтверждали секвенированием.
Гены рекомбинантных рибосомных белков L1 и их мутантные формы экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3) [3]. Во избежание ошибочного включения аминокислот в архейные белки (лизина вместо аргинина [8]) клетки котрансфор-мировали плазмидой pUBS 520. Эта плазмида не-
Ars
сет ген аргининовой тРНК (тРНКАОА/АОО), узнающей редкие для E. coli кодоны аргинина AGA и AGG [9], а также ген kan, обуславливающий устойчивость к канамицину.
Процедуры выделения всех мутантных форм белков MjaLl и TthLi идентичны. Биомассу ре-суспендировали в лизирующем буфере (50 hM Tрис-Ha, pH 7.6, 25°C, 0.8 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ß-MeEtOH, 0.i mM PMSF). Разрушение вели двумя пассажами через пресс Френча. Дебрис из разрушенной биомассы и рибосомы удаляли центрифугированием. Термолабильные белки E. coli
удаляли прогреванием при 65-75°C в течение 20 мин с последующим центрифугированием. Су-пернатант диализом переводили в буфер для хроматографии (50 мМ NaAc, pH 5.5, 150 мМ NaCl, 5 мМ P-MeEtOH). Белок очищали с помощью ка-тионообменной хроматографии (СМ-Sepharose). При элюции использовали линейный градиент хлорида натрия от 0.15 до 0.8 М в буфере 50 мМ NaAc pH 5.5, 5 мМ p-MeEtOH.
Кристаллизацию проводили методом диффузии паров в висячей капле при 6°C (мутантные формы MjaLl) и 22°C (мутантные формы TthLi).
Растворы мутантных форм белка MjaLl (в 50 мМ Трис-HCl буфера, рН 7.5, 25°С, 350 мМ NaCl) концентрировали до 20 мг/мл на центрико-не с отсечением 10 кД (Amicon). Белок смешивали с противораствором 33% ПЭГ 10000, 0.1 М Hepes/KOH, рН 7.5, 5% метилпентандиолом (МПД) в соотношении 3 : 2.5 и уравновешивали противораствором. Кристаллы появлялись через 2-3 дня и вырастали до максимальных размеров 0.3 мм х 0.2 мм х 0.1 мм в течение недели. Кристаллы были хрупкие и таяли при комнатной температуре, поэтому их фиксировали в парах 0.25% раствора глутарового альдегида в течение двух часов при комнатной температуре. Такие кристаллы успешно использованы для сбора дифракционных данных. Перед заморозкой в жидком азоте кристаллы мутантных форм белка MjaL1 переносили в криораствор: 21% бутан-2,3-диол, 1.5% ПЭГ 10000, 50 мM Hepes/KOH, pH 7.5.
Растворы мутантных форм белка TthL1 с концентрацией 12-15 мг/мл были отдиализованы в 100 мМ глицин/NaOH буфера, pH 10.0, 30% сульфата аммония, 5% МПД. Капли, содержащие 810 мкл раствора белка, уравновешивали против 60% сульфата аммония с 7% МПД. Кристаллы появлялись через 3-4 дня и вырастали до максимального размера 0.4 мм х 0.3 мм х 0.2 мм в течение недели. Перед замораживанием в жидком азоте кристаллы переносили в криораствор: 30% глюкозы с 60% сульфата аммония.
Сбор и обработка дифракционных данных.
Набор дифракционных данных для каждого из полученных кристаллов собран от одного кристалла на синхротроне DESY в Гамбурге (Германия) на линиях EMBL X12 и EMBL BW7B с использованием MAR CCD детектора и на синхротроне SLS в Швейцарии на станции PX. Полученные наборы данных были обработаны в программном комплексе XDS [10]. Характеристики дифракционных данных приведены в табл. 1 и 2.
Определение пространственной структуры мутантных форм. Все структуры определены методом молекулярного замещения с использованием программы PHASER [11]. В качестве старто-
Таблица 1. Статистические характеристики дифракционных наборов и уточнения структур мутантных форм белка MjaL1
Параметры E27A T204A E27A/T204A T204F M205D
Статистика наборова' 6
Пространственная группа Р1 Р1 Р1 Р1 C2
Параметры ячейки, Â, ° a = 33.8 а = 34.0 a = 34.0 a = 33.9 a = 133.3
b = 39.0 b = 38.5 b = 39.1 b = 38.4 b = 33.7
с = 54.8 с = 55.2 с = 55.3 с = 55.1 с = 123.3
а = 83.0 а = 82.3 а = 83.1 а = 83.0 а = 90.0
в = 79.5 в = 78.8 в = 79.7 в = 79.3 в = 114.2
Y = 75.5 Y = 76.7 Y = 75.3 Y = 76.2 Y = 90.0
Пределы разрешения, Â 25.0-2.1 16.0-2.0 25.0-2.14 16.0-1.90 25.0-2.87
(2.20-2.10) (2.10-2.03) (2.20-2.14) (1.95-1.90) (3.0-2.87)
Длина волны, Â 0.843 0.843 0.843 0.843 1.072
Общее число отражений 40754 (5166) 45184 (3997) 56067 (3520) 56301 (4116) 43089 (49
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.