КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2011, том 56, № 4, с. 751-753
РОСТ ^^^^^^^^^^^^^^^^ КРИСТАЛЛОВ
УДК 548.735.2
Посвящается памяти Б.К. Вайнштейна
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА ДВУХДОМЕННОГО N-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА АРХЕЙНОГО РИБОСОМНОГО БЕЛКА L10 (P0) СО СПЕЦИФИЧЕСКИМ ФРАГМЕНТОМ 23S рРНК
© 2011 г. О. В. Кравченко, И. В. Митрошин, А. Г. Габдулхаков, С. В. Никонов, М. Б. Гарбер
Институт белка РАН, Пущино E-mail: garber@vega.protres.ru Поступила в редакцию 28.02.2011г.
Боковой Ь12-выступ (в археях Р1-выступ, в эукариотах Р1/Р2-выступ) является необходимым морфологическим элементом большой рибосомной субчастицы всех изученных организмов. Он образован комплексом рибосомных белков L10(P0) и L12(P1) и взаимодействует с 23S рРНК через белок L10(P0). L12(Р1)-выступ вовлечен в образование ГТФазного центра рибосомы и играет важную роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции. Из-за высокой подвижности данного выступа его кристаллическая структура до сих пор полностью не определена в составе рибосомы. Были получены кристаллы комплекса двухдоменного N-концевого фрагмента рибосомного белка L10(P0) из археи Methanococcus jannaschii со специфическим фрагментом рРНК из того же организма. Кристаллы отражают рентгеновские лучи с разрешением 3.2 А.
ВВЕДЕНИЕ
Во всех исследованных организмах большая рибосомная субчастица содержит функционально важный боковой выступ, называемый в бактериях Ь12-выступ, в археях — Р1-выступ и в эукариотах — Р1/Р2-выступ [1]. Этот боковой выступ вовлечен в образование ГТФазного центра рибосомы и играет важную роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции и в контроле точности трансляции [2]. Изолированные рибо-сомные белки, входящие в состав данного рибо-сомного выступа, образуют в растворе стабильный комплекс, который через N-концевой домен белка L10(P0) связывается с большой рибосомной РНК. Архейные рибосомные белки Р0 и Р1 существенно отличаются от своих бактериальных гомологов L10 и L12 и близки по первичной структуре эукариотическим рибосомным белкам Р0 и Р1/Р2. Однако РНК-связывающий домен белков L10 и Р0 чрезвычайно консервативен по своей структуре и способен связываться со столь же консервативным фрагментом рибосомной РНК из любого организма. Показано, что архей-ный и эукариотический комплексы Р0-Р1 могут in vitro замещать в бактериальной рибосоме комплекс L10-L12, причем получившаяся гибридная рибосома начинает узнавать архейные и эукарио-тические факторы элонгации, но перестает узнавать свои бактериальные факторы [3].
Структура рибосомной 50S субчастицы из археи Haloarcula marismortui определена около десяти лет тому назад с разрешением 2.4 Ä, но Р1-вы-ступ в этой модели отсутствовал полностью [4]. Позднее структура N-концевого РНК-связываю-щего домена белка P0(L10) была локализована в этой модели 50S субчастицы на уровне низкого разрешения [5]. Совсем недавно этот РНК-свя-зывающий домен белка L10 визуализовали на карте электронной плотности бактериальной 70S рибосомы, сокристаллизованной с фактором элонгации EF-G [6]. Попытки определить структуру изолированных компонентов L12-выступа оказались более успешными. На данный момент известны кристаллические структуры С-конце-вого домена бактериального рибосомного белка L7/L12 из E. coli [7] и изолированного белка L12 из бактерии Thermotoga maritima [8]. Определена также структура комплекса белка L10 с N-конце-выми доменами белка L12 из T. maritima [2]. Совсем недавно определили пространственную структуру комплекса белка P0 из археи Pyrococcus horikoshii с N-концевыми доменами белка Р1 [9]. В 2010 г. определили кристаллическую структуру двухдоменного N-концевого фрагмента белка L10(P0) из гипертермофильной археи Methanococcus jannaschi [10]. Этот фрагмент содержит как N-концевой РНК-связывающий домен, структура которого была определена ранее и законсервирована во всех доменах жизни, так и следующий
752
КРАВЧЕНКО и др.
(a)
a a
agcagccauccuu gagugcgu a | | | | | iii • iii- u
gauucgguuggag
g-ca
g-c
-c g c
(б)
aa
agcagccauccuu gagugcgu a MINI- III- .
95 нт
gauucgguuggag
cucg
g
'aca-
ag-
g
au-a
c-g
c-g
g . u
g-c
u-a
u-a
c-g
c-g
u • g
ag-c
ag-c
g-c
1140- g-c-1235
g
g-c
g-c
cg c
aca
74 нт
ac-g
a-u
ag—c a g
au-a
c-g
c-g
1151-g-c-1224
Рис. 1. Предполагаемая вторичная структура Mja 23S рРНК-95нт (а) и Mja 23S рРНК-74нт (б).
домен, который соответствует специфической вставке в аминокислотных последовательностях белка Р0 из архей и эукариот, но отсутствует в бактериальном белке Ь10.
В данной работе описана кристаллизация комплекса двухдоменного М-концевого фрагмента белка Ь10(Р0) из гипертермофильной археи М. ]аппазскИ со специфическим фрагментом 238 рРНК. Получены кристаллы комплекса, отражающие рентгеновские лучи с разрешением 3.2 А. Знание кристаллической структуры этого комплекса позволит уточнить модель архейной рибосомы и детально описать взаимодействия между белком Ь10 и рРНК.
Рис. 2. Кристалл комплекса MjaL10NTF c Mja 23S рРНК-74нт.
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА N-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА БЕЛКА L10(F0) С 95-ТИ НУКЛЕОТИДНЫМ ФРАГМЕНТОМ 23S рРНК
Поскольку полноразмерный белок L10^0) нестабилен в растворе и с 23S рРНК взаимодействует своей N-концевой частью, был использован N-концевой фрагмент этого белка (MjaL10NTF) для получения и кристаллизации комплекса со специфическим фрагментом 23S рРНК.
MjaL10NTF и специфический 95-ти нуклео-тидный фрагмент 23 рРНК из M. jannaschii (Mja 23S рРНК-95нт) были выделены и очищены, как описано в [10, 11].
MjaL10NTF (2.5 мг/мл в 10 мМ трмс-HCl, pH 7.0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ) смешивали в молярном отношении 1 : 1 c Mja 23S рРНК-95нт (3.5 мг/мл в 10 мМ трмс-HCl, pH 7.0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ) и инкубировали в течение 30 мин при температуре 4°С для образования комплекса. Предварительно препарат фрагмента рРНК прогревали при температуре 65°С в течение 10 мин, затем охлаждали до комнатной температуры. Для кристаллизации белка использовали метод диффузии паров в висящей капле [12]. Препарат комплекса (2 мкл) помещали в центр силиконированного покровного стекла размером 22 х 22 х 1.5 мм, затем добавляли к белку равный объем раствора осадителя, используя коммерческий набор растворов для кристаллизации (Natrix, Hampton Research). К полученной капле был добавлен цетилтриметиламмоний бромид до концентрации 0.5 мМ для предотвращения агрегации комплекса. Стекло с каплей помещали над стаканчиком с 0.5 мл противораство-ра. Края стаканчика предварительно смазывали вакуумной смазкой. Кристаллизацию проводили при температуре 22°С. Через 3—4 дня кристаллы
КРИСТАЛЛОГРАФИЯ том 56 № 4 2011
KPИCTAЛЛИЗAЦИЯ KOMOTEKCA ДВУXДOМEHHOГO N-KOHЦEВOГO ФPAГМEHTA
753
комплекса появлялись в каплях с №1;пх № 26. Данные кристаллы отражали рентгеновские лучи только в зоне низкого разрешения. Было обнаружено, что в процессе кристаллизации 95-ти нук-леотидный фрагмент 238 рРНК становится короче на несколько нуклеотидов. Для получения стабильного и гомогенного препарата РНК длинная шпилька М]а 238 рРНК-95нт, нижняя часть которой не участвует во взаимодействии с белком Ь10, была укорочена на 21 нуклеотид (рис. 1). Известно, что удаление других спиралей в данном фрагменте рРНК приводит к ослаблению или полной потере связывания с белком Ь10 [11].
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА Mja L10NTF С 74-Х НУКЛЕОТИДНЫМ ФРАГМЕНТОМ 23S рРНК
Фрагмент ДНК, кодирующий L10(Р0)-связы-вающий 74-х нуклеотидный фрагмент 23S rRNA из M. jannaschii (Mja 23S рРНК-74нт), был ампли-фицирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клонирован в вектор pUC18. Полученный ПЦР-фрагмент содержал в своем составе T7 промотор и сайты рестрикции для ферментов NarI и HindIII. Сайт рестрикции для фермента Egel использовался для линеризации плазмиды перед транскрипцией. Специфический фрагмент 23S рРНК длиной 74нт нарабатывался методом транскрипции in vitro. Для выделения и очистки Mja 23S рРНК-74нт использовалась методика, разработанная для Mja 23S рРНК-95нт [11]. Формирование комплекса Mja 23S рРНК-74нт с MjaL10NTF и его кристаллизацию выполняли, как описано для комплекса Mja 23S рРНК-95нт с MjaL10NTF. Через 3—4 дня в тех же условиях появились кристаллы комплекса (рис. 2), которые достигали своего максимального размера в течение 1—1.5 недель. Уменьшение длины специфического фрагмента 23S рРНК с 95-ти до 74-х нуклеотидов позволило получить более упорядоченные кристаллы комплекса. На синхротро-
не Bessy (Берлин, Германия) был снят набор дифракционных данных от кристаллов комплекса MjaL10NTF c Mja 23S pPHK-74нт с разрешением 3.2 А. ^посредственно перед съемкой кристаллы были мгновенно заморожены при температуре 100 K в струе жидкого азота. Перед заморозкой кристаллы вымочили в течение короткого времени в криорастворе (0.05 M какодилат натрия, pH 6.5, 0.2 M KCl, 1 M ацетат магния, 15% полиэтилен гликоль 8000, 15% глицерин). В настоящее время ведется работа по определению пространственной структуры комплекса.
Paботa выполнена при финансовой поддержке Программы MKБ PAH, Федерального агентства по науке и инновации ^K № 02.740.11.0295) и Pоccийcкого фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-00327а).
CПИCOK ЛИTEPATУPЫ
1. Liljas A., Gudkov A. // Biochimie. 1987. V. 69. P. 1043.
2. Diaconu M., Kothe U., Schlünzen F. et al. // Cell. 2005. V. 121. P. 991.
3. Nomura T., Nakano K., Maki Y. et al. // Biochem J. 2006. V 396. P. 565.
4. Ban N., Nissen P., Hansen J. et al. // Science. 2000. V. 289. P. 905.
5. Kavran J., Steitz T. // JMB. 2007. V 371. P. 1047.
6. Gao Y., Selmer M., Dunham C. et al. // Science. 2009. V. 326. P. 694.
7. Leijonmarck M., Liljas A. // J. Mol. Biol. 1987. V. 95. P. 555.
8. Wahl M., Bourenkov G., Bartunik H. et al. // EMBO J. 2000. V. 19. P. 174.
9. Naganuma T., Nomura N., Ya M. et al. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 4747.
10. Kravchenko O., Mitroshin I., Nikonov S. et al. // J. Mol. Biol. 2010. V. 399. P. 214.
11. Shcherbakov D., Dontsova M., Tribus M. et al. // Nucl. Acids Res. 2010. V 34. P. 5800.
12. Davies D., Segal D. // Methods Enzymol. 1971. V. 22. P. 266.
12 KPИCTAЛЛOГPAФИЯ том 56 № 4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.