научная статья по теме КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ -СУБЪЕДИНИЦЫ АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 Химия

Текст научной статьи на тему «КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ -СУБЪЕДИНИЦЫ АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 1, с. 76-79

СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

УДК 548.735.2

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ у-СУБЪЕДИНИЦЫ АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2

© 2014 г. В. И. Архипова, Е. А. Столбоушкина, О. С. Никонов, А. Г. Габдулхаков, М. Б. Гарбер

Институт белка РАН, Пущино E-mail: v.arkhipova@vega.protres.ru Поступила в редакцию 03.04.2013 г.

Архейный фактор инициации трансляции 2 (aIF2) гомологичен соответствующему эукариотиче-скому фактору (eIF2) и представляет собой гетеротримерный белок, состоящий из субъединиц а, в и у. В составе тройственного комплекса с гуанозин-5'-трифосфатом и инициаторной метионил-тРНК (Met-тРНК;) e/aIF2 доставляет Met-тРНК; на рибосому. В археях фактор инициации трансляции 2 имеет дополнительную функцию: у-субъединица aIF2 связывает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, и защищает их от 5'-3'-направленной деградации. Чтобы определить место связывания мРНК на поверхности aIF2y, в последовательность белка внесены мутации в участки предположительного взаимодействия с мРНК. Мутантные формы aIF2y закристаллизованы, с полученных кристаллов собраны дифракционные наборы данных, пригодные для исследования пространственных структур при атомарном разрешении.

DOI: 10.7868/S0023476114010020

ВВЕДЕНИЕ

В эукариотах и археях фактор инициации трансляции 2 состоит из трех субъединиц

(а, в и у). В процессе инициации трансляции е/а1Ё2, связанный с гуанозин-5'-трифосфатом (ГТФ), доставляет инициаторную метионил-тРНК (Met-тРНКi) в Р-участок малой рибосом-ной субчастицы. После узнавания инициирующего кодона мРНК антикодоном Ме^тРНК и гидролиза ГТФ фактор е/а1Б2 в комплексе с гуа-нозин-5'-дифосфатом (ГДФ) покидает рибосому. Последующий обмен ГДФ, связанного с е/а1Б2, на ГТФ возвращает фактору способность образовывать комплекс с Ме^тРНК; и вступать в новый раунд инициации трансляции. В археях а1Б2 помимо доставки Мет-тРНК; на рибосому имеет дополнительную функцию: у-субъединица а1Б2 связывает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, и защищает их от 5'-3'-направленной деградации [1]. В настоящее время структура комплекса а1Б2у с мРНК неизвестна, и участок связывания мРНК на белке не определен.

у-Субъединица е/а1Б2 относится к семейству б-белков, содержащих ГТФ/ГДФ-связывающий домен. Структура нуклеотидсвязывающего кармана в этих белках высоко консервативна. В дальнейшем будем называть этот сайт связывания нуклеотидов на поверхности б-домена е/а1Б2у "каноническим". Ведется работа по исследованию структуры у-субъединицы а1Б2 в нескольких состояниях: в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ. В ре-

зультате анализа структуры а1Б2у в комплексе с нуклеотидами впервые обнаружен еще один сайт связывания ГТФ на поверхности у-субъединицы, который в дальнейшем будем называть "дополнительным" [2 и неопубликованные данные]. Функция дополнительного ГТФ-связывающего сайта пока остается невыясненной. Эксперименты по конкурентному связыванию показали, что мРНК и ГТФ конкурируют между собой за связывание с у-субъединицей а1Б2. На основании этого сделано предположение, что местом для взаимодействия 5'-конца мРНК на белке может служить один из ГТФ-связывающих сайтов (канонический или дополнительный). Чтобы локализовать участок связывания мРНК на белке, были начаты работы по получению пригодных к структурным исследованиям кристаллов комплекса а1Б2у с мРНК, однако попытки не увенчались успехом. Поэтому было решено провести направленный мутагенез обоих ГТФ-связывающих сайтов а1Б2у, чтобы выяснить, какие мутации приводят к изменению сродства этого белка к ГТФ и мРНК. Анализ пространственных структур му-тантных форм белка в комплексе с негидроли-зуемым аналогом ГТФ позволит определить, связывается ли по-прежнему нуклеотид с измененным ГТФ-связывающим сайтом. Также на основании этих структурных данных можно будет сделать вывод о том, какие изменения в структуре белка произошли в результате введенных мутаций и как эти изменения могли повлиять на связывание с мРНК.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ

77

Рис. 1. Стереометрическое изображение пространственной структуры аШ2у в комплексе с ГДФ (в каноническом нук-леотидсвязывающем сайте) и негидролизуемым аналогом ГТФ — GDPNP (в дополнительном ГТФ-связывающем сайте). PDB-код: 2PMD. Черными нумерованными сферами обозначены позиции атомов Са соответствующих аминокислотных остатков, измененных в результате введенных мутаций либо ограничивающих делетированные участки. Черным цветом выделен участок петли 8,ш1:сЫ, в котором были проведены делеции. Отмечены N и С концы полипептидной цепи.

В настоящей работе описаны получение му-тантных форм у-субъединицы а1Б2 из гипертермофильной археи 8и1/о1оЬт зоумапеш и их кристаллизация в комплексе с нуклеотидами. С кристаллов, пригодных для рентгеноструктур-ного анализа, собраны наборы дифракционных данных.

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ а1Б2у

Мутации в гене, кодирующем у-субъединицу а1Б2, проводили на основании анализа структур нуклеотидсвязывающих карманов известных моделей а1Б2у и соответствующих контактов, образованных белком и нуклеотидом [2]. Чтобы дестабилизировать положение ГТФ в дополнительном сайте связывания, введены следующие мутации: точечные одиночные замены — К225А и Я280А; двойная замена — К225Д/Я280А; тройная замена — Р221А/К225А/Я280А; делеции подвижного функционально важного участка switch1 (А37—47 и А41—45), который также принимает участие в формировании дополнительного ГТФ-связываю-щего сайта. В области канонического нуклеотид-

связывающего сайта проведена замена H20F. На рис. 1 показана пространственная структура aIF2y в комплексе с ГДФ и GDPNP (гуанозин-5'-(Р,у-имидо)-трифосфатом), расположенными в каноническом и дополнительном сайтах соответственно (в [2] структура определена с разрешением 2.65 А). Отмечены аминокислотные остатки и участки полипептидной цепи белка, изменившиеся в результате мутаций, наличие которых подтверждено секвенированием гена. Экспрессию мутантных вариантов гена у-субъединицы aIF2 проводили в клетках Escherichia coli C41(DE3) (Imaxio) с использованием системы Штудиера [3]. После индукции экспрессии с помощью ИПТГ (изопропил-Р^-тиогалактозида) клетки осаждали и разрушали ультразвуком. Выделение мутантных форм aIF2y проводили по схеме, разработанной для выделения белка дикого типа [2].

Полученные мутантные формы aIF2y проверены методом гель-шифта на способность связывать мРНК. Для связывания использовался 5'-концевой фрагмент мРНК белка L1 Methanococcus jannaschii длиной 47 нуклеотидов. Оказалось, что

78

АРХИПОВА и др.

Рис. 2. Фотографии кристаллов мутантных форм аШ2у в комплексе с нуклеотидами: а — кристаллы аШ2у (Д37—47) со смесью GDPNP и ГДФ, полученные в присутствии формиата натрия; б — кристаллы аШ2у (Р221Л/К225Л/К280Л) с GDPCP, полученные в присутствии малоната натрия.

мутации, внесенные в дополнительный ГТФ-связывающий сайт, не повлияли на мРНК-свя-зывающие свойства белка: мутантные формы а1Б2у связывали мРНК в эквимолярных количествах, как и белок дикого типа, а ГТФ и мРНК продолжали конкурировать между собой за связывание с мутантными формами белка. В то же время точечная мутация Н20Б, внесенная в область канонического нуклеотидсвязываю-щего сайта а1Б2у, значительно ослабила связывание белка с мРНК. По-видимому, данный нуклеотидсвязывающий сайт принимает непосредственное участие во взаимодействии мРНК и белка.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ aIF2y С НУКЛЕОТИДАМИ

Для кристаллизации мутантных форм aIF2y использовался метод диффузии паров в висящей капле [4], в качестве лигандов — негидролизуемые аналоги ГТФ: 44 мМ GDPCP (гуанозин-5'-ф,у-метилен)-трифосфат) или 50 мМ GDPNP (с примесью ГДФ ~ 30%). Препарат белка (50 мг/мл в 50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 400 мМ NaCl, 10 мМ Р-меркаптоэтанол) объемом 2 мкл помещали в центр силиконированного покровного стекла размером 22 х 22 х 1.5 мм, к нему добавляли 0.5 мкл раствора нуклеотида и 2 мкл осадителя. В случае мутантных форм aIF2y с мутациями R280A, Д37—47 и H20F использовались условия № 33 коммерческого набора растворов для кристаллизации ClearStrategyII, MolecularDimen-sionsLimited (4 М формиат натрия, 0.1 М како-дилат натрия, pH 6.5). Стекло с каплей помещали над стаканчиком с 0.4 мл противораствора. Кристаллизация проводилась при температуре

28°C. Кристаллы белка появлялись через 2—3 дня и достигали своего максимального размера в течение 1—1.5 недель (рис. 2а). Непосредственно перед сбором дифракционных данных кристаллы подвергались кратковременному вымачиванию в криорастворе (3 М формиат натрия, 0.085 M какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль), после чего были мгновенно заморожены при температуре 100 K в струе жидкого азота.

При кристаллизации мутантных форм aIF2y с тройной заменой F221A/K225A/R280A и делеци-ей Д41—45 к смеси белка с нуклеотидом добавляли 2 мкл 1.9 М малоната натрия со значениями pH от 4.7 до 6.0. Противораствор содержал 1.2 М ма-лоната натрия с соответствующим значением pH и 3% (v/v) 2-метил-2,4-пентандиол. Кристаллы появлялись на 3—4 день при температуре 22°C и прекращали свой рост через 1.5—2 недели (рис. 2б). При съемке кристаллов на синхротроне использовалась описанная выше методика, но с другим криораствором: 1.9 М малоната натрия, pH 4.7—6.0, 15% (v/v) этиленгли-коля.

С полученных кристаллов собраны наборы дифракционных данных на синхротроне BESSY II (Берлин), линия BL14.1 HZB с длиной волны 0.9184 А, оснащенная детектором MX-225 CCD фирмы Rayonics (Evanston, USA) и системой охлаждения кристаллов Cryojet XL [5]. Предварительная обработка данных на синхротроне проводилась программой XDSAPP [6], окончательная — в программном комплексе XDS [7]. Предварительные параметры структурных данных представлены в таблице. В настоящее время ведется работа по определению пространствен-

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ

79

Предварительные параметры структурных данных дифракционных наборов, собранных с кристаллов комплексов мутантных форм аТГОу с нуклеотидами

Мутантная форма aIF2y Нуклеотиды Предел разрешения, А Пр. гр. Параметры ячейки a, b, c, А а, ß, у, град

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»