УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2011, том 131, № 3, с. 260-269
УДК 612.119:611.013.1
КРИТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
© 2011 г. И.А. Орловская1, С.К. Халдояниди2
1 Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск 2 Торри Пайнс институт молекулярных исследований, Сан Диего, США
E-mail: irorl@mail.ru
Обзор сфокусирован на методах генерирования гемопоэтических клеток из эмбриональных стволовых клеток с помощью стратегий, основанных на создании условий гемопоэтического микроокружения in vitro с использованием фидерных клеток, цитокиновых коктелей и различных матриц. Обсуждаются проблемы повышения эффективности гемопоэтической дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и сохранения функциональных свойств гемопоэтических клеток для дальнейшего использования в клинике.
Ключевые слова: эмбриональная стволовая клетка, эмбриоидные тельца, гемопоэтическая стволовая клетка, гемопоэтическая ниша, дифференцировка, ростовые факторы.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), выделенных из костного мозга, мобилизованной периферической крови и пупо-винной крови, широко используется в регенеративной медицине [14]. Тем не менее клиническое использование таких ГСК лимитируется угрозой развития реакции "трансплантат против хозяина" (в ситуациях с использованием аллогенных ГСК), а также ограниченными возможностями получения необходимого для трансплантации количества ГСК. Несмотря на то что существуют способы повышения экспансии ГСК ex vivo, известные к настоящему времени режимы кондиционирования страдают рядом недостатков, которые снижают функциональную активность трансплантируемых ГСК. Следовательно, поиск альтернативных источников ГСК для трансплантации является актуальной задачей. Одним из потенциальных источников ГСК являются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые обладают неограниченной способностью к пролиферации и могут дифференцироваться in vitro в мультипотентные ГСК. Один из экспериментальных подходов к получению ГСК из ЭСК, основанный на создании условий гемопоэтического микроокружения in vitro (моделирование ниши ГСК), базируется на накопленных к настоящему моменту знаниях о биологии фетальной и постнатальной гемопоэтиче-ских ниш.
РОЛЬ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ НИШИ В ОПРЕДЕЛЕНИИ "СУДЬБЫ" ГСК
Три десятилетия назад была сформулирована концепция гемопоэтической ниши [49], и в течение этого времени накапливались данные о ее биологии. Понятие гемопоэтической ниши включает клеточные и неклеточные компоненты. Поскольку клеточная структура и неклеточные элементы гемопоэтической ниши млекопитающих до сих пор не полностью охарактеризованы, в настоящее время не представляется возможным реконструировать нишу в условиях in vitro и создать условия для неограниченной экспансии ГСК или, по крайней мере, продлить период времени, в течение которого ГСК сохраняют свои свойства. Сегодня нет единого мнения о том, какими клеточными типами представлена ниша. Изначально костномозговые клетки всех типов назывались стромальными. Данные гистологических исследований показали, что так называемая костномозговая "строма" представлена популяциями клеток различных типов и дифферонов. Таким образом, термин "стромальная клетка" страдает неопределенностью, поскольку зачастую употребляется не только по отношению к клеткам микроокружения, но и к фибробластам, источником которых является мезенхимальная стволовая клетка (МСК) [16, 31, 44, 45]. Поскольку субпопуляции костно-
мозговых клеток могут быть охарактеризованы с помощью специфических маркеров, термин "костномозговая строма", таким образом, может рассматриваться как устаревший. Например, недавно идентифицированы клетки, вовлеченные в регуляцию процесса самоподдержания ГСК: остеобласты, эндотелиальные клетки и фибробла-стоподобные клетки [8, 25, 47, 51]. В большинстве исследований для каждого клеточного типа охарактеризована их способность поддерживать ГСК, но совершенно очевидно, что для оптимального функционирования ниши необходимо взаимодействие присутствующих в костном мозге клеток различных типов. Таким образом, если ниша является структурой, поддерживающей процесс гемопоэза in vivo, где самоподдержание ГСК - только часть этого процесса, то она может рассматриваться как комплексная многоклеточная структура, состоящая из клеточных элементов как мезенхимального, так и гемопоэтического происхождения.
Как указано выше, до сих пор не удавалось реконструировать in vitro функционирующую гемопоэтическую нишу, тем не менее попытки генерирования клеточных линий, способных поддерживать пролиферацию и дифференцировку ГСК, были весьма результативны. Однако полученные клеточные линии могут поддерживать ге-мопоэз только в течение ограниченного периода времени. Первые полученные линии - мышиные фибробластоподобные стромальные клеточные линии S17 и MS5 [12, 20]. Позже получили другие клеточные линии мышей [19] и человека [48]. Некоторые из этих клеточных линий успешно использовались для индукции дифференцировки ЭСК в гемопоэтические линии, что будет обсуждаться ниже. Более того, учитывая тот факт, что в процессе онтогенеза ГСК происходит смена микроокружения (aorta-gonad-mesonephros (AGM), фетальная печень и фетальный костный мозг), были сделаны успешные попытки получения клеточных линий из этих органов и исследована их способность к генерированию ГСК из ЭСК [30, 52].
Функционирование клеток, образующих структуру ниши, опосредовано экспрессией поверхностных молекул, растворимых факторов и молекул экстраклеточного матрикса (ECM). Таким образом, если бы молекулярная структура ниши была полностью исследована, можно было бы создать in vitro "синтетическую", или "рекомбинантную", функционирующую нишу. В последние годы затрачены значительные усилия, чтобы охарактеризовать адгезивные молекулы, экспрессирующие-ся на клетках гемопоэтических линий и клетках
микроокружения [19]. В течение последних десятилетий также интенсивно исследовались растворимые факторы, регулирующие пролиферацию ГСК [6, 34, 55]. In vivo растворимые факторы представляют собой хорошо сбалансированную систему позитивных и негативных регуляторов гемопоэза. Идентифицировано множество таких факторов и для ряда из них (главным образом позитивных регуляторов) показана способность поддерживать гемопоэтическую дифференциров-ку ГСК. Еще одним из важнейших структурных компонентов гемопоэтической ниши являются молекулы ECM [18, 24, 33], однако их роль в ге-мопоэтической дифференцировке ЭСК недостаточно изучена. Настоящий обзор посвящен методам генерирования ГСК из ЭСК, основанным на создании условий гемопоэтического микроокружения in vitro.
ПРОБЛЕМЫ И ОГРАНИЧЕНИЯ СУЩЕСТВУЮЩИХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОДХОДОВ
Ранние исследования гемопоэтической диффе-ренцировки ЭСК не ставили целью создание протоколов для получения больших количеств ГСК, способных удовлетворять потребностям клиники. В большинстве случаев изучалась роль отдельных факторов в генерировании гемопоэтических клеток. Следствием такого подхода было получение эмпирических знаний и разработка протоколов дифференцировки ЭСК без учета онтогенеза гемопоэтической системы. Другой проблемой ранних работ являлось отсутствие систематических исследований клоногенности in vitro, что затрудняло оценку количества гемопоэтических предшественников в культуре дифференцированных ЭСК. Более того, практически отсутствовали исследования репопулирующей активности предшественников in vivo, позволяющие охарактеризовать количественные и качественные параметры ГСК, полученных из ЭСК. Второстепенные параметры, такие как морфология и экспрессия гемопоэтических маркеров, не позволяют в полной мере оценить или сравнить эффективность отдельных протоколов.
Одним из существенных ограничений многих исследований является использование сыворотки животных в культуральной среде, в то время как в современных протоколах используется бессывороточная среда, что позволяет стандартизировать культуральные условия и повысить воспроизводимость результатов. И наконец, протоколы диф-ференцировки ЭСК в ГСК должны быть нацелены
на перспективу их дальнейшего использования в клинической практике.
В настоящее время для индукции гемопоэ-тической дифференцировки ЭСК предлагаются различные подходы, включающие использование фидерного слоя, образование эмбриоидных телец (embryoid body, EB), цитокиновые коктейли, а также комбинации этих подходов.
МОДЕЛИРОВАНИЕ КОСТНОМОЗГОВОЙ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ НИШИ: КЛЕТОЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ НИШИ
В КОМБИНАЦИИ С РАСТВОРИМЫМИ РОСТОВЫМИ ФАКТОРАМИ
В этой главе будут проанализированы протоколы гемопоэтической дифференцировки ЭСК мышей (МЭСК) и приматов, основанные на использовании фидерных клеток.
Использование фидерного слоя (в том числе
в комбинации с цитокинами) для индукции гемопоэтической дифференцировки мышиных ЭСК (мЭСК)
Первоначальные эксперименты по индукции гемопоэтической дифференцировки мЭСК проводили с помощью стромальной клеточной линии OP9 [35]. В процессе сокультивирования с OP9 клетками мЭСК дифференцировались в клетки, из которых впоследствии генерировались зрелые эритроциты. Поскольку, наряду с эрит-роидными, регистрировались также миелоидные и лимфоидные клетки, авторы заключали, что ГСК, полученных в данных экспериментальных условиях, являются мультипотентными [34]. Предполагалось также, что OP9 клетки поддерживают выживание ГСК благодаря отсутствию экспрессии M-CSF, цитокина, стимулирующего макрофагальную дифференцировку ГСК [35]. Тем не менее позднее было показано, что M-CSF не влияет на способность OP9 стимулировать гемопоэтическую дифференцировку ЭСК и поддерживать ГСК [61]. В дальнейшем этот экспериментальный протокол дополнялся внесением ге-мопоэз-поддерживающих цитокинов. Например, добавление тромбопоэтина (Tpo), IL-6 и IL-11 в культуральную систему мЭСК+ОР9 индуцировало мегакариоцитопоэз с дальнейшей продукцией протромбоцитов [15]. Сокультивирование в бессывороточной среде Flk-1+клеток, выделенных из дифференцированных мЭСК, с OP9 клетками в присутствии эритропоэтина (Epo) стимулировало эритроидную д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.