научная статья по теме КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ IN VITRO КОРНИ КОПЕЕЧНИКА ЧАЙНОГО И ОБРАЗОВАНИЕ В НИХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Биология

Текст научной статьи на тему «КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ IN VITRO КОРНИ КОПЕЕЧНИКА ЧАЙНОГО И ОБРАЗОВАНИЕ В НИХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 604-613

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ

УДК 581.1

КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ IN VITRO КОРИИ КОПЕЕЧНИКА ЧАЙНОГО И ОБРАЗОВАНИЕ В НИХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

© 2007 г. М. Ю. Вдовитченко*, И. Н. Кузовкина*, X. Пэтц**, Б. Шнайдер**

*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва ** Институт химической экологии им. Макса Планка, Йена, Германия Поступила в редакцию 11.09.2006 г.

Введены в культуру in vitro стабильно растущие генетически трансформированные корни ценного лекарственного растения Алтая копеечника чайного (Hedysarum theinum Krasnob.), полученные при использовании Т-ДНК Ri-плазмиды (pRi) дикого штамма А4 Agrobacterium rhizogenes. Исследован состав вторичных веществ корней in vitro и корней интактных проростков копеечника и установлено, что их основными низкомолекулярными метаболитами являются изофлавоноиды. В результате препаративной ВЭЖХ из метанольного экстракта культивируемых корней копеечника выделены 4 вещества, которые были идентифицированы на основании данных ХН- и 13С-ЯМР-спектрометрии как формононетин, ононин (гликозид формононетина), малонилононин и гликозид тексазина. Качественный состав вторичных метаболитов генетически трансформированных корней и корней проростков копеечника практически идентичен, за исключением того, что в корнях ювенильных растений отсутствовал малонилононин. Апробирована технология получения "искусственных семян" на основе культивируемых in vitro корней копеечника и доказана возможность их использования в качестве ризогенного инокулята. Введенные в культуру корни копеечника чайного рассматриваются как потенциальный источник экологически чистого лекарственного сырья, а "искусственные семена" с корневым инокулятом - как возможный способ размножения и сохранения этого ценного растения.

Hedysarum theinum -Ri-плазмида Agrobacterium rhizogenes - генетически трансформированные корни (hairy roots) - "искусственные семена" - изофлавоны - формононетин - ононин

ВВЕДЕНИЕ

Копеечник чайный (Hedysarum theinum Ю^-поЬ.) - многолетнее травянистое растение, называемое также красным корнем, относится к сем. бобовых ^аЬасеае) и к роду Hedysarum, который насчитывает более 120 видов растений [1, 2]. Как самостоятельный вид копеечник чайный был выделен из популяции копеечника забытого (Hedys-агит neglectum Ledeb.) в 1985 г. Красноборовым, однако до сих пор ряд авторов часто называют красным корнем другие виды копеечника - тот же Н. neglectum Ledeb.[3] и копеечник южносибирский (Н. austrosibiricum В. Fedtsch.) [4, с. 273]. Причиной нечеткого систематического положения копеечника чайного является большое морфологическое сходство копеечников разных видов. Единственным диагностическим признаком копеечника чайного, отличающим его от близко-

Сокращения: ТФУ - трифторуксусная кислота; В5 - среда Гамборга; pRi - Ri-плазмида; - время удерживания. Адрес для корреспонденции: Кузовкина Инна Николаевна. 127276 М осква, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: kuzovkin@ippras.ru

родственных видов Hedysarum - Н. neglectum и Н. austrosibiricum, является буровато красная окраска излома корней, что, по мнению ряда авторов, связано с содержанием в них вторичных метаболитов фенольной природы, которые и обусловливают лечебные свойства подземных органов растений этого вида [5-7]. Корни копеечника чайного находят широкое применение в народной медицине Сибири и используются как болеутоляющее, кроветворное, противовоспалительное и диуретическое средство [7]. Большой популярностью у жителей Алтая пользуется тонизирующий и общеукрепляющий напиток, приготовляемый из корней копеечника. Он обладает приятным вкусом и имеет красный цвет, что и определило народное название растения - "красный корень".

В настоящее время отсутствуют четкие данные о химическом составе корней копеечника чайного. Высказывались предположения о том, что водные и спиртовые экстракты корней этого растения содержат, в отличие от других видов копеечника, значительные количества фенольных соединений. Имеются также сведения о том, что в состав компонентов этого растения могут вхо-

дить олигомерные катехины и лейкоантоцианы, с которыми и может быть связан цвет и тонизирующее действие экстрактов, приготовленных из его корней [5, 6]. Однако эти данные основаны лишь на результатах цветных реакций экстрактов корней копеечника с рядом реагентов (хлорное железо, ванилиновый реактив) или бумажной хроматографии с проявлением этими же агентами и, в целом, не подкреплены систематическим анализом с выделением и конечной идентификацией вторичных веществ, содержащихся в корнях растения.

Копеечник чайный имеет весьма ограниченный ареал произрастания и встречается как редкий высокогорный вид на богатых гумусом горно-лесолуговых субальпийских почвах Алтая, Тарбагатая, Памира и Монголии, а также в некоторых степных и луговых биоценозах Сибири, имеющих почвы с достаточным увлажнением и хорошим дренажом [5; 8, с. 165]. Размножается растение только семенами, которые образуются у особей 8-10-летнего возраста. Неконтролируемый сбор растения и его невысокая семенная продуктивность привели к тому, что с 1995 г. копеечник чайный включен в Красную книгу Горного Алтая.

Ценные целебные свойства растения, ограниченность его произрастания, а также отсутствие четких морфологических признаков, позволяющих безошибочно выявлять копеечник чайный из природной популяции растений вида Hedys-arum, являются предпосылками для разработки биотехнологических приемов культивирования клеток растения in vitro, причем наиболее перспективным может быть введение в культуру именно корней этого растения. Ранее такие попытки были предприняты авторами, которым удалось получить каллусные культуры других растений этого рода - копеечника забытого и копеечника альпийского [3]. Известно, что культивирование недифференцированно растущих клеток растений не всегда гарантирует сохранение биосинтеза видоспецифичных соединений в условиях in vitro. Кроме того, выращивание клеточных культур на питательной среде, содержащей ростовые вещества, существенно ограничивает вероятность дальнейшего использования получаемой растительной массы и, тем самым, снижает ценность метода.

Задачей настоящей работы было введение в культуру in vitro корней копеечника чайного с использованием Т-ДНК Ri-плазмиды (pRi) дикого (немодифицированного) штамма Agrobacterium rhizogenes и их последующий химический анализ.

МЕТОДИКА

Растительный материал. Свежесобранные семена достоверно идентифицированного копеечника чайного (Hedysarum theinum Krasnob.), полученные в Ботаническом саду Новосибирска, обезжиривали 5-минутным погружением в этиловый спирт, обрабатывали в течение 3 мин концентрированной серной кислотой, после чего тщательно отмывали стерильной дистиллированной водой. Такой способ обработки семян обеспечивал не только стерилизацию, но и скарификацию семян. Простерилизованные семена помещали в чашки Петри на агаризованную питательную среду Стрита [9] и выдерживали их в течение 4-5 дней при 26°С в темноте. Проросшие и неконтамини-рованные семена переносили в биологические пробирки на питательную среду того же состава. Выращивание ювенильных растений проводили при температуре 26°С на свету (12-часовое освещение люминесцентными лампами). После появления пары настоящих листьев надземную часть проростков отделяли, разрезали на сегменты, которые после осторожного накалывания иглой ин-сулинового шприца помещали в жидкую питательную среду МС [10], содержавшую суспензию 48-часовой почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes. Для инокуляции эксплантов проростков был использован дикий (немодифицирован-ный) штамм A. rhizogenes (А4). После 24-часовой инкубации эксплантов с агробактерией растительный материал промывали стерильной питательной средой МС и переносили на агаризованную среду того же состава, содержавшую 500 мг/л клафорана для элиминирования самой агробактерии.

После проявления признаков генетической трансформации сформировавшиеся адвентивные корни отделяли от эксплантов и пересаживали их на питательную среду Гамборга (В5) [11], содержавшую уменьшенную дозу антибиотика (250 мг/л) для полного освобождения от бактерии. При первой пересадке образовавшихся корней сохраняли часть ювенильного растения, из которой был инициирован их рост, что обеспечивало сохранение хорошей ростовой активности корневого инокулята. После 3-5 последующих пересадок непосредственно корневых эксплантов на агаризованную среду и достижения полной ак-сеничности культуры корни переносили в жидкую питательную среду того же состава, и полученные генетически трансформированные корни, так называемые "hairy roots", выращивали на качалке (90 об./мин) в темноте при температуре 26°С. Стабильно растущая культура корней копеечника существует в коллекции генетически трансформированных корней ИФР РАН с 2001 г.

Пересадки полученных корней проводили через каждые 6-8 нед., используя для этого экс-планты корневой культуры весом 500-750 мг, ко-

торые помещали в 50 мл жидкой питательной среды.

На введенных в культуру корнях копеечника был апробирован способ получения так называемых "искусственных семян" (artificial seeds). Для их получения использовали 4-недельную культуру корней, выращенную в жидкой питательной среде. Молодую часть корней нарезали на сегменты длиной в 3-4 мм в количестве около 200 штук, которые суспендировали в питательной среде В5 с добавлением 3% альгината натрия. Взвесь корневых сегментов переносили по каплям автоматической пипеткой со срезанным концом в 70 мМ CaCl2 для замещения натрия на кальций и капсулирования сегментов корней в альги-нате кальция. Время выдерживания капсул в растворе CaCl2 составляло 10 мин, после чего получившиеся "искусственные семена" промывали дистиллированной водой, переносили на агаризо-ванную среду В5 и использовали для работы. Часть "семян" помещали в условия низких положительных температур (4°С) и по истечении 24 нед. проращивали на среде В5 при 26°С в темноте.

Ростовую активность корневой культуры копеечника оценивали по рост

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком