УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2014, том 134, № 1, с. 19-25
УДК 57.085.23
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК В МОДЕЛИРОВАНИИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ
© 2014 г. Е. Н. Филатова, О. В. Уткин
Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора E-mail: el.filatova83@gmail.com
Культуры клеток являются современным инструментом, позволяющим in vitro воспроизводить реакции живого организма в ответ на инфекцию разной этиологии. В настоящем обзоре описаны основные подходы к моделированию инфекционных процессов с применением клеточных культур, представлены их преимущества и недостатки. Рассмотрены модели, использующие в своей основе монокультуры и смешанные культуры клеток различного типа, а также первичные культуры и постоянные клеточные линии, обладающие двухмерной и трехмерной пространственной структурой. Обсуждаются проблемы интерпретации и соответствия результатов, полученных с помощью моделей in vitro, процессам, протекающим при инфицировании in vivo.
Ключевые слова: культура клеток, инфекционный процесс, моделирование in vitro.
ВВЕДЕНИЕ
Многие достижения современной биологии стали возможны благодаря использованию разных типов клеток, выделенных из организма и поддерживаемых в жизнеспособном состоянии в искусственных условиях. Культуры клеток нашли широкое применение в моделировании многих физиологических и патофизиологических процессов in vitro, в том числе инфекционного генеза. Их использование позволяет исследовать ключевые моменты взаимодействия вирусного, бактериального или паразитарного патогена с клетками хозяина. В обзоре описаны клеточные модели, используемые для изучения жизненного цикла различных возбудителей инфекционных заболеваний человека. Дана оценка особенностей применения культур клеток в зависимости от задач исследования.
ПРЕИМУЩЕСТВО КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ ПО СРАВНЕНИЮ С ЖИВОТНЫМИ МОДЕЛЯМИ
Выбор подходящей модели для изучения инфекционного процесса in vitro важен для адекватной экстраполяции полученных данных на процессы, протекающие в живом организме. В историческом плане изначально использовались
животные модели, которые с успехом применяются и в настоящее время. В ряде случаев их использование не имеет альтернатив. Прежде всего, это касается исследований в области вирусологии. До сих пор шимпанзе является единственной модельной системой, позволяющей оценивать инфекционный потенциал клонов вируса гепатита С, а также эффективность разрабатываемых вакцин против этой инфекции (Bukh, 2004). Лабораторное культивирование клинических штаммов астровирусов, ротавирусов и норовирусов человека имеет низкую эффективность и требует живых организмов (Straub et al., 2007; Arnold et al., 2009; Finkbeiner et al., 2012). Животные модели остаются незаменимыми при проведении доклинических исследований терапевтических препаратов.
Тем не менее, их применение имеет свои недостатки и ограничения. Мелкие животные (крыса, мышь, хомяк) не являются естественными хозяевами актуальных инфекций человека (Maines et al., 2008; Kuiken et al., 2010; McDermott et al., 2011; Aly et al., 2012). Использование животных моделей усложняет анализ функционирования генов, участвующих в патогенезе заболевания, а также манипуляций с ними.
Альтернативой, лишенной недостатков животных моделей, является культура клеток. Ее преимущество над животными моделями особенно
выражено при проведении генетических исследований с целью определения роли и степени участия генов в патогенезе заболеваний инфекционной природы. Кроме того, применение культур клеток предполагает использование небольшого количества экспериментального материала с возможностью прижизненного мониторинга его состояния и корректировки условий культивирования.
ПЕРВИЧНЫЕ И ПОСТОЯННЫЕ МОНОКУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
Многие модели in vitro основаны на использовании клеток единого происхождения - монокультур. На данный момент охарактеризовано большое количество монокультур. Их применение обеспечило основу для понимания ключевых особенностей взаимодействия между патогеном и хозяином при инфицировании вирусом гепатита С (Bartenschlager, Lohmann, 2001; Aly et al., 2012), Haemophilus influenzae, Campylobacter jejuni, Neospora caninum и др. (De Melo et al., 1989; Oelschlaeger et al., 1993; St. Geme, 2002; Friis et al., 2005; Hemphill et al., 2006). Так использование монокультур способствовало расшифровке механизма презентации бактериальных антигенов М-клетками эпителия кишечника (Man et al., 2004; Tyrer et al., 2006). Применение культуры клеток линии Caco-2 (аденокарцинома толстой кишки) позволило установить характер взаимоотношений между кишечным эпителием и труднокультивируемым аденовирусом группы F (Martin-Latil et al., 2004; Sherwood et al., 2012).
Монокультуры подразделяют на первичные (диплоидные) культуры и постоянные (имморта-лизованные) клеточные линии. Первичные культуры получают из живой ткани, они гетерогенны и физиологически близки к аутентичной ткани, но зачастую обладают низким уровнем репликации и воспроизводства патогена, а также ограниченной способностью к пересеву (Lanford et al., 1994; Bartenschlager, Lohmann, 2001; Bengrine et al., 2007; Jerchel et al., 2012). Из-за присущего первичным культурам лимита деления клеток (лимит Хейфлика) они лучше всего подходят для краткосрочных исследований. Первичные культуры клеток находят свое применение для выявления особенностей жизненного цикла патогенов, обладающих ограниченным тропизмом. Например, первичные культуры клеток печени человека и шимпанзе широко применяются для изучения особенностей жизненного цикла вируса гепати-
та С, обладающего высокой гепатотропностью. В данном случае первичные культуры обладают метаболическими характеристиками клеток печени in vivo, но проявляют ограниченные потенции к делению (Gondeau et al., 2009; Aly et al., 2012).
Постоянные клеточные линии представлены клетками лишь одного типа и могут использоваться длительное время. Большинство постоянных культур клеток получено из злокачественно трансформированных клеток, что определяет их способность к неограниченному делению. По сравнению с нетрансформированными клетками того же типа в таких культурах наблюдаются изменения в регуляции клеточного цикла, характере экспрессии генов и других морфофункцио-нальных свойствах (Delgado et al., 2005; Фрешни, 2010).
Для постоянных клеточных линий характерны изменения в уровнях экспрессии клеточных рецепторов, динамики продукции цитокинов, скорости пролиферации (Finke et al., 1993; Rumin et al., 1999; Chamberlain et al., 2009; Holt et al., 2010). Эти изменения оказывают значительный эффект на итог взаимодействия хозяина и патогена. Например, первичные уроэпителиальные клетки мочевого пузыря млекопитающих экс-прессируют на своей поверхности уроплакино-вые протеины (Wu et al., 1994), важные для адгезии уропатогенов и развития воспалительного процесса (Valle et al., 2008; Mabbett et al., 2009; Ulett et al., 2010). Иммортализованные линии уроэпителиальных клеток данные протеины не экспрессируют (Olsburgh et al., 2003), а следовательно, не подходят для изучения инфекций мочевого пузыря. В первичных клетках эпителия желудка мыши наблюдается экспрессия катеп-сина-Х, не детектируемая в иммортализованных клетках. Данный факт сопровождается снижением адгезивных свойств к патогену (Bernhardt et al., 2010).
Однако для пролонгированных исследований, предъявляющих высокие требования к постоянству свойств клеток, характеру их роста и скорости наращивания биомассы, применение постоянных клеточных линий является более эффективным по сравнению с первичными культурами (Duell et al., 2011). Так для изучения свойств вируса полиомиелита, а также при производстве вакцин используют постоянные линии клеток WI-38, MRC-5 и Vero, поскольку получение первичной культуры клеток, пригодной для трансфекции вирусами, является сложной и дорогостоящей процедурой (Furesz, 2006).
ПРОБЛЕМЫ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ IN VITRO ИССЛЕДОВАНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ МОНОКУЛЬТУР
В противоположность сложным моделям in vivo, монокультуры различного происхождения обеспечивают упрощенный, более низкий по стоимости анализ. При моделировании инфекционного процесса они позволяют вести селективную многопараметрическую оценку в разных типах клеток, исследовать механизмы инвазии и особенности протекания жизненного цикла конкретного патогена (Duell et al., 2011).
Вместе с тем, существенным недостатком монокультур является неспособность моделировать сложные биологические процессы, которые происходят в тканях in vivo. Например, для эффективной активации CD4+ Т-клеток, инкубируемых с Burkholderia pseudomallei, необходим контакт с дендритными клетками моноцитарного происхождения (Tippayawat et al., 2011).
Другим примером является активация макрофагов. In vivo она достигается взаимодействием и кооперацией разных типов клеток. Для активации макрофагов in vitro требуется липополисахарид, интерферон-гамма и другие эндогенные факторы (Gretzer et al., 2006; Chamberlain et al., 2009; Schutte et al., 2009a). При этом эффективность процесса активации многократно снижается (Schutte et al., 2009b; Holt et al., 2010). Таким образом, широта применения и очевидные преимущества монокультур не отменяют тех ограничений, которые возникают в ходе моделирования инфекционных процессов in vitro.
Важной проблемой в интерпретации результатов является сложность стандартизации при работе с монокультурами (Полянская, 2008; Маркарян и др., 2011). Культивирование является дестабилизирующим фактором, так как сопряжено с постоянным применением дезагрегирующих агентов при пересеве клеток (Bengrine et al., 2007; Matej et al., 2007; Rasmussen et al., 2011), сменой куль-туральной посуды, ростовой среды и т.п. (Delie, Rubas, 1997; Фрешни, 2010). Такие факторы, как рН среды (Morita et al., 1991), увеличение концентрации атмосферного кислорода (Gille et al., 1989), понижение температуры (Rao, Engelberg, 1965), культивирование с антибиотиками способны усилить кариотипическую нестабильность клеточных линий (Полянская, 2008). Подобные отклонения могут приводить к отсутствию в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.