ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 430, № 6, с. 844-846
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.460
Z-NAME-ВЫЗВАННАЯ ИНТЕНСИВНАЯ ПРОТЕИНУРИЯ
У ЗДОРОВЫХ КРЫС © 2010 г. А. В. Кутина, В. В. Захаров, Е. И. Шахматова, академик Ю. В. Наточин
Поступило 21.07.2009 г.
Выделение с мочой белка, особенно альбумина, рассматривается как симптом ранних стадий поражения почек, когда еще отсутствуют клинические и иные лабораторные признаки болезни [4, 6]. Недавно нами в экспериментах на здоровых крысах было установлено, что резкое увеличение мочеотделения сопровождается повышением количества экскретируемого белка [2]. Механизм протеинурии мог быть связан с изменением проницаемости гломерулярного фильтра для белков и состоянием гемодинамики почечных клубочков, в регуляции которой важную роль играет оксид азота (N0) [5]. Для проверки предположения об участии N0 возникла идея ввести животным Х^АМЕ (метиловый эфир Х-нитроаргинина), который вызывает системную блокаду образования N0, конкурируя с субстратом N0-синтазы — аргинином [7]. Задачей настоящей работы послужило исследование особенностей протеинурии при подавлении продукции N0.
Эксперименты проводили на самках крыс линии Вистар с массой тела 150—220 г. Х^АМЕ вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг массы тела, после чего через 15 мин вызывали увеличение мочеотделения введением крысам: 1) воды 50 мл/кг через зонд в желудок, 2) 1 мл/кг 1%-ного раствора фу-росемида в/м, 3) 0.5 мкг/кг 1-дезамино-аргинин-вазотоцина (1ё-АУГ) в/м в объеме 1 мл/кг; или инъецировали в/м такой же объем физиологического раствора (1 мл/кг). Контролем служили подобные серии экспериментов без введения Х^АМЕ. Сбор мочи проводили в индивидуальных клетках-пеналах с мерными пробирками. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ИЭФБ РАН.
Измеряли объем мочи, определяли концентрацию креатинина кинетическим методом, общего белка — пирогаллоловым реактивом на автомати-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
ческом анализаторе EOS Bravo W (Италия), натрия — на пламенном фотометре Corning 410 (Великобритания), альбумина — иммунофермент-ным методом с использованием набора фирмы "Bethyl Laboratories" (США) на автоматическом ридере ELx800 ("BIO-TEK Instruments", США). Для электрофореза белков мочи подготовку проб осуществляли методом, подробно описанным ранее [2]. Электрофорез в денатурирующих условиях проводили по стандартной методике [8] в 8 и 12%-ном полиакриламидном геле. Для окрашивания белков в геле использовали коллоидный раствор Кумасси G250. Синтез аналога вазотоци-на 1d-AVT был выполнен ЗАО "Синтез пептидов" [3]. В работе использованы Z-NAME ("Sigma-Aldrich", Германия) и фуросемид (Лазикс, "Авентис Фарма", Индия). Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 6. Данные представлены в виде M ± а. Межгрупповые различия оценивались по тесту ANOVA Крускала—Уоллиса и критерию Данна для множественных сравнений [1].
Внутрибрюшинная инъекция Z-NAME приводила к небольшому увеличению мочеотделения, возрастала экскреция натрия с мочой, статистически значимо не менялась скорость клубоч-
кДа -
250 160
105 75
50
1 2
3
Рис. 1. Электрофоретическое исследование сыворотки крови и мочи при введении Х^АМЕ. 1 — моча (Х^АМЕ 50 мг/кг), 2 — моча (Х^АМЕ 50 мг/кг + + Ы-АУГ 0.5 мкг/кг), 3 — сыворотка крови.
Х-МАМЕ-ВЫЗВАННАЯ ИНТЕНСИВНАЯ ПРОТЕИНУРИЯ 845
Таблица 1. Особенности функционального состояния почек крыс при разных типах диуреза в условиях действия Х-МАМЕ
Условие опыта п ^2ч, мл UPvV2ч, мг и^к2'1 мкмоль ССг, мл/мин
№С1 10 0.4 ± 0.3 0.14 ± 0.08 20 ± 16 0.27 ± 0.13
Х-МАМЕ + №С1 9 0.8 ± 0.4а 2.8 ± 2.0а 80 ± 62а 0.23 ± 0.10
Фуросемид 10 4.4 ± 0.7 0.36 ± 0.15 416 ± 52 0.19 ± 0.04
Х-МАМЕ + фуросемид 10 3.6 ± 0.5б 1.1 ± 0.4а 398 ± 57б 0.21 ± 0.09
ВН 10 4.7 ± 0.6 0.37 ± 0.07 9 ± 6 0.23 ± 0.04
Х-МАМЕ + ВН 8 4.5 ± 1.4б 5.0 ± 3.4а,б 192 ± 106а 0.21 ± 0.05
Ы-АУТ 10 1.4 ± 0.5 0.42 ± 0.14 409 ± 100 0.26 ± 0.09
Х-МАМЕ + Ы-АУТ 9 1.4 ± 0.5б 22.1 ± 11.6а,б 349 ± 133б 0.30 ± 0.11
Примечание. Все показатели рассчитаны на 100 г массы тела, п — число животных. К24, ЦргУ24 и и-^аКч — объем выделенной мочи, экскреция общего белка и натрия с мочой за 2 ч эксперимента, ССг — клиренс креатинина. №С1 — 0.9%-ный раствор №С1, ВН — водная нагрузка. а — значимость различий (р < 0.05) по отношению к контролю, б — к Х-МАМЕ + №С1.
ковой фильтрации (ССг), но экскреция белков значительно увеличилась (табл. 1). Электрофорез проб мочи при действии Х-МАМЕ показал наиболее интенсивное выделение белков с молекулярной массой 65—70 кДа, в частности, альбумина. Обнаружено появление небольшого количества крупномолекулярных белков плазмы крови, но их вклад в экскрецию общего белка невелик (рис. 1). Таким образом, при действии Х-МАМЕ развивается протеинурия: преимущественно увеличивается экскреция белков, имеющих размер, близкий диаметру пор гломерулярной мембраны. Известно, что основными факторами, ограничивающими прохождение белков через гломерулярную мембрану, являются размер пор и отрицательный заряд [6]. Возникло предположение, что ведущим фактором развития Х-МАМЕ-зависимой протеинурии является изменение состояния гломерулярного фильтра.
Изучение влияния Х-МАМЕ на экскрецию белков проведено при разных вариантах поли-урии у крыс. Водная нагрузка способствовала повышению уровня протеинурии в 1.8 раза, а инъекция
1ё-АУТ — в 7.9 раза. В то же время рост мочеотделения при действии фуросемида не изменял протеи-нурию. В отличие от контроля (рис. 2а) во всех случаях полиурии при действии Х-МАМЕ экскретиру-емый белок был преимущественно представлен альбумином (рис. 2б), а спектр выделяемых белков был схожим (рис. 3). На фоне действия 1ё-АУТ не только существенно повышался уровень протеи-нурии, но в моче появлялись белки большей молекулярной массы, что выявлено при электрофорезе проб в 8%-ном полиакриламидном геле (рис. 1). Увеличение мочеотделения в проведенных экспериментах было обусловлено разными механизмами. Отсутствие изменения выделения белков при введении Х-МАМЕ и фуросемида и резкое усиление альбуминурии при сочетании Х-МАМЕ и 1ё-АУТ ясно свидетельствуют о том, что не поли-урия как таковая, а внутринефронные эффекты антидиуретического гормона и Х-МАМЕ оказывают определяющее действие на резкое усиление экскреции белков. Вероятно, изменение уровня Х-МАМЕ-зависимой протеинурии при действии как водной нагрузки, так и 1ё-АУТ, при участии разных меха-
Рис. 2. Экскреция общего белка и альбумина за 2 ч эксперимента при разных типах диуреза (а) и одновременном действии Х-МАМЕ (б). 1 — в/м инъекция фуросемида 10 мг/кг, 2 — введение воды 50 мл/кг через зонд в желудок, 3 — в/м инъекция Ы-АУТ 0.5 мкг/кг, 4 — контроль. Звездочка — значимость различий (р < 0.05) по сравнению с контролем.
846
КУТИНА и др.
кДа
66.2 45 31
21.5
5
Рис. 3. Электрофоретическое исследование проб мочи при разных типах диуреза после введения Z-NAME. 1 — контроль, 2 — Z-NAME 50 мг/кг, 3 — Z-NAME 50 мг/кг + фуросемид 10 мг/кг, 4 — Z-NAME 50 мг/кг + водная нагрузка 50 мл/кг, 5 — Z-NAME 50 мг/кг + 1d-AVT 0.5 мкг/кг. Каждая полоса — проба от отдельного животного.
низмов связано с повышением внутриклубочко-вого давления, что способствует прохождению через гломерулярный фильтр большего количества белков.
Полученные впервые результаты показывают, что у здоровых млекопитающих существует N0-зависимый механизм регуляции проницаемости гломерулярного фильтра для белков в почке. Поскольку не только протеинурия, но и микроальбуминурия в клинике рассматриваются как возможный признак развития патологического состояния в почке, описываемые в нашей работе данные о возможности N0-зависимой альбуминурии у здоровых крыс приобретают важное прикладное значение, указывая на то, что возможны ситуации, когда увеличение экскреции белков не связано с развитием воспалительного процесса в почке.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 08—04—00610) и программы ОБН РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
2. Кутина А.В., Захаров В.В., Наточин Ю.В. // Бюлл. эксперим. биологии. и медицины. 2008. Т. 146. № 12. С. 613-616.
3. Наточин Ю.В, Канашкина Т.А., Шахматова Е.И. и др. // Эксперим. и клин. фармакология. 2008. Т. 71. № 2. С. 32-35.
4. Тареева И.Е., Полянцева Л.Р. В кн.: Нефрология. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2000. С. 145-163.
5. Baylis C, Qiu C. // Kidney Int. 1996. V. 49. P. 17271731.
6. Comper W.D., Osicka T.M., Russo L.M. In: Seldin and Giebisch's The Kidney. Physiology and Pathophysiology. Amsterdam: Elsevier, 2008. V. 2. P. 2081-2112.
7. Harry G.J., Sills R., SchlosserM.J., Maier W.E. // Neu-rotox. Res. 2001. V. 3. № 3. P. 307-319.
8. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680685.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.