УДК 577.27
ЛИМФОМИЕЛОИДНЫЕ КЛЕТКИ МЫШИ СПОСОБНЫ НОРМАЛЬНО ФУНКЦИОНИРОВАТЬ В УСЛОВИЯХ ЗНАЧИТЕЛЬНОГО СНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ЦИТОХРОМА с
© 2014 Е.С. Шилов1*, И.В. Кисляков1, Е.А. Горшкова1, Р.В. Зварцев2, М.С. Друцкая2, И.А. Муфазалов2, В.П. Скулачев2, С.А. Недоспасов3*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
биологический факультет, 119991 Москва; электронная почта: shilov_eygeny@inbox.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
3 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, д. 32; факс: +7(499)135-1405, электронная почта: sergei.nedospasov@gmail.com
Поступила в редакцию 23.07.14
Цитохром с является незаменимым компонентом системы переноса электронов дыхательной цепи митохондрий, а также важным медиатором внутреннего пути запуска апоптоза. Известно, что удаление гена соматического цитохрома с приводит к гибели мышиных эмбрионов. Используя технологию ЬохР-сге-зависимой тканеспецифической рекомбинации, мы получили несколько линий мышей со значительно сниженным уровнем экспрессии цитохрома с в отдельных типах клеток («кондиционный генетический нокдаун»). Нокдаун обеспечивается нарушением нормального сплайсинга пре-мРНК локуса Cycs за счет дополнительного акцепторного сайта, содержащегося в стоп-кассете пеог. Ранее нами была показана летальность гомозиготных мышей с таким нокдауном цитохрома с во всех клетках организма. В данной работе мы изучили две новые линии мышей с кондиционным нокдауном Cycs в Т-лимфоцитах и макрофагах. Неожиданно оказалось, что мыши обеих линий в нормальных условиях содержания не имеют фенотипических отличий от мышей дикого типа, как на уровне всего организма, так и на уровне жизнедеятельности отдельных клеток-мишеней. Таким образом, имеющееся в лимфомиелоидных клетках количество цитохрома с не является пороговым для их развития и нормального функционирования.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитохром с, генетический нокдаун, Т-лимфоциты, макрофаги, сге-рекомбиназа, сплайсинг.
Цитохром с является жизненно важным компонентом системы окислительного фосфо-рилирования, при этом он также играет важную роль в защите от активных форм кислорода и служит триггером для образования апоптосомы в процессе активации внутреннего пути апоптоза [1]. У многих животных этот белок существует в нескольких изоформах, например, у грызунов есть два гена цитохрома с (Cycs и СусО, кодирующие соответственно соматическую и тести-кулярную изоформы [2]. Нокаут тестикулярного цитохрома с приводит к преждевременной атрофии семенников, однако не вызывает стерильность у самцов [3]. С другой стороны, полная де-леция гена Cycs, кодирующего основной, сома-
* Адресат для корреспонденции.
тический вариант цитохрома с, летальна на стадии Е8—Е10 эмбриогенеза [4]. На уровне культур мышиных фибробластов отсутствие в них цитохрома с не является препятствием для культивирования, но требует добавления в среду пи-рувата и уридина, так же как в случае р0 клеток с повреждением митохондриальной ДНК [5]. Однако лишенные цитохрома с клетки имеют дефекты сборки полноразмерных комплексов дыхательной цепи I и IV, снижение доли кардиоли-пина среди мембранных липидов митохондрии [6], а также нарушение индукции клеточного ответа на гипоксию из-за неспособности к накоплению стабилизированных прогипоксических факторов транскрипции ИГР-1 и ИГР-2 [7]. В то же время известно, что почкующиеся дрожжи cerevisiae с различными мутациями, нарушаю-
1724
щими функции изоформы 1 цитохрома с, на которую приходится ~95% общего количества этого белка, способны поддерживать работу дыхательной цепи посредством оставшихся 5% изоформы 2. При этом критерием, позволяющим отличить мутантов по гену cyc1, кодирующему эту мажорную изоформу, от двойных мутантов или мутантов по другим, уникальным генам белков дыхательной цепи, является способность дрожжей расти на среде с глицерином либо этанолом в качестве единственного метаболического субстрата [8]. Таким образом, есть основания предполагать, что цитохром с в дыхательной цепи митохондрий обычно присутствует в количестве, значительно большем, чем минимально достаточное для ее функционирования. В настоящей работе мы исследовали этот вопрос in vivo и in vitro, используя уникальных мышей, в которых количество цитохрома c в клетке могло регулироваться с помощью LoxP-Cre технологии.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение мышей с кондиционным дефицитом цитохрома с в Т-клетках и макрофагах. Использовали мышей на генетической основе линии С57ВЬ/6. Создание генетической конструкции cfKW было описано ранее [9, 10]. Для получения мышей с дефицитными по цитохрому c макрофагами делецию аллели дикого типа гена Cycs проводили с помощью рекомбиназы сге под промотором макрофагального лизоцима LysM, для Т-клеток использовали ген Cre под промотором гена Cd4. В качестве контроля были использованы мыши других генотипов из тех же пометов, что и цитохромдефицитные, которые имели нормальное количество этого белка во всех клетках организма.
Генотипирование мышей проводили методом ПЦР на матрице ДНК, выделенной из кончиков хвостов мышей (возраст > Р25). Протокол лизиса тканей и выделения ДНК идентичен таковому для процедуры выделения ДНК из макрофагов и описан в соответствующем разделе. Для определения генотипа локуса Сycs использовали праймеры сугех2 - 5'-AGAGATGCAGAGGTTAAGTG-3' и суИ2 - 5'-TGACCTTGCCTTCTTCGG-3' (локус дикого типа дает ПЦР-продукт размером 520 п.н., локус cfKWдает ПЦР-продукт размером 609 п.н.). Проверку наличия в мышах гена рекомбиназы LysM-Cre проводили с использованием прайме-ров Сге8 - 5'-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3' и М1у82 - 5'-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3'. Для определения генотипа локуса Cd4 использовали конкурентную ПЦР с тремя праймерами:
CD4cre1-5'-ATCAAGGTCCTGAGGAAGAG-3',
CD4cre2-5'-ACCTCATCACTCGTTGCATC-3',
CD4cre3-5'-CTAGGAGTTGTGCTGCACAG-3'.
Для всех вышеуказанных ПЦР использовали одну и ту же оптимизированную программу: 94°, 3 мин; затем 35 циклов — 94°, 40 с; 60°, 45 с; 72°, 60 с; заключительная элонгация — 72°, 5 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле и визуализировали с помощью окрашивания бромистым этидием.
Выделение и поляризация костномозговых макрофагов. Мышей (возраст 6—8 недель) эвта-назировали, препарировали, извлекали бедренные кости и выделяли из них костный мозг, вымывая его из диафиза кости в пробирку со стерильной бессывороточной средой DMEM. Затем проводили подсчет клеток костного мозга в камере Горяева, далее их рассаживали на чашки Петри (d = 100 мм) в количестве 7 млн на 7 мл культуральной среды. Состав среды стимулировал дифференцировку клеток костного мозга в макрофаги и соответствовал стандартному протоколу, описанному ранее [11]. На 7-й день культивирования клетки снимали с чашек стерильным раствором 0,05% EDTA на PBS и пересевали для поляризации на чашки Петри (d = 35 мм) в количестве 1 млн клеток на чашку, в 2 мл культуральной среды. Для поляризации макрофагов использовали рекомбинантные мышиные цитокины IFN у и IL-4 («PeproIech», США), а также ЛПС E. coli («Sigma», США). Для каждого клона использовали М1 поляризацию (IFN у в концентрации 50 нг/мл и ЛПС — 50 нг/мл), также проводили поляризацию у-ин-терфероном в той же концентрации отдельно от ЛПС, М2 поляризацию (IL-4 в концентрации 20 нг/мл), а также использовали неполяризо-ванные клетки в качестве контроля. Через сутки производили окрашивание клеток на специфические маркеры, а также проводили выделение ДНК и РНК.
Вестерн-блоттинг. Использовали макрофаги, лизированные в буфере Лэммли (по 2 х 106 кл/про-бу). Лизат макрофагов подвергали процедуре SDS-PAGE в системе Mini-Protean («Bio-Rad», США), затем переносили методом влажного переноса на активированную метанолом PVDF-мембрану Amersham Hybond-P («GE Healthcare», Великобритания), блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина («Sigma», США) на PBS и проявляли с помощью первичных мо-ноклональных антител к цитохрому с («BD Pharmingen», США) и поликлональных кроличьих антител к гистону H2B («Abcam», Великобритания). Для проявления использовали вторич-
ные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, и набор ECL West Dura («Pierce», США), сигнал регистрировали с помощью люминесцентного имиджера ChemiDoc («Bio-Rad»).
Выделение ДНК. Для количественной оценки работы LysMcre/loxP-системы и определения эффективности вырезания аллеля дикого типа Cycs, ДНК выделяли из 2—5 млн костномозговых макрофагов. Выделение проводили по стандартному протоколу для выделения ДНК из клеток мышей от Jackson Laboratory с протеиназой К («Amresco», США).
Выделение РНК для последующего синтеза первой цепи кДНК и анализа экспрессии методом ПЦР в реальном времени для культур костномозговых макрофагов проводили по методу Хомчинского [12] с реактивом TRI Reagent («Sigma») по протоколу производителя.
Реакцию обратной транскрипции проводили со случайными девятинуклеотидными праймерами с помощью набора Reverse Transcriptase SS III («In-vitrogen», США) по протоколу производителя. Для каждого образца в реакции использовали по 400 нг суммарной РНК, прошедшей предварительную обработку ДНКазой I («Thermo Scientific», США) для удаления остаточной геномной ДНК.
ПЦР в реальном времени. Относительную экспрессию и соотношение аллелей определяли с помощью метода AACt, описанного ранее [13]. Для определения экспрессии в качестве референс-ного гена использовали ген бета-актина мыши, при определении соотношения аллелей WT и K72Wреференсной считали аллель K72W, которая не подвержена Cre-зависимому вырезанию. Для определения экспрессии аллели дикого типа использовали праймеры: Cyc-1exF: 5'-CGTCT-GTCTTCGAGTCCG-3' и CycLys-R: 5'-TTC-
Для определения экспрессии аллели K72W — праймеры: Cyc-1exF и CycTrp-R: 5'-TTCCAGG-GATGTACTTCCAT-3'.
Для определения экспрессии тестикулярной формы цитохрома с применяли праймеры: CycT-F: 5'-CAGGGCACGGCTGCTGTGAT-3' и CycT-R: 5'-CCACCGTGTGGCACTGAGCA-3'.
Для определения экспрессии ß-актина использовали праймеры: actin-longF: 5'-C
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.