УДК 577.217
ЛИНЕЙНАЯ СТРУКТУРА ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ ТОЧКИ НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ ДНК AMPD2 ЛОКУСА МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2014 г. КА Лима Нето, Ф.С. Рандо, В.Б. Фрейтас, Л.Ф. Родригес, Ф.Р. Росадо, А. Фиорини, Ф. Жименес, Дж. Таварес, M.A. Фернандес*
Departamento de Biotecnología, Genetica e Biología Celular, Universidade Estadual de Maringa, UEM, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringa, Parana, Brasil; fax: 55(44)3011-4893, E-mail: mafernandez@uem.br; aparecidafernandez@gmail.com
Поступила в редакцию 28.05.13 После доработки 29.08.13
Идентификация консенсусных нуклеотидных последовательностей точек начала репликации у млекопитающих представляет собой сложную противоречивую задачу. Согласно одной из интересных гипотез, локальная топология ДНК может играть роль при ее узнавании белковыми факторами репликации. Элементы вторичной структуры ДНК, в том числе внутренние изгибы ДНК, легко выявить, и они могут являться признаком специфической структуры в пределах или рядом с точками начала репликации млекопитающих. В данной работе при помощи анализа in silico и метода циклической перестановки проведено полное картирование участков внутренних изгибов ДНК (IBDS, the intrinsically bent DNA sites) в точках начала репликации oriGNAI3, oriC, oriB и oriA амплифицированного домена гена AMPD2 млекопитающих. Полученные результаты свидетельствуют о том, что каждая точка начала репликации содержит сайт IBDS, фланкирующий ее центральный участок. Кроме того, согласно in silico анализу расположения нуклеосом, центр IBDS находится в участке, свободном от нуклеосом (NFR, nucleosome-free región). В статье рассмотрены структуры каждого из этих участков искривления ДНК, а также их геометрические параметры и топология. Представленные в настоящей статье данные указывают на то, что точка начала репликации oriGNAI3, преимущественно использующаяся для инициации репликации в амплифицированном домене AMPD2, является единственной, в которой обнаружен прямой узкий участок, фланкированный с обеих сторон двумя участками внутреннего изгиба ДНК на небольшом расстоянии (~300 пар нуклеотидов, п.н.). Однако во всех точках начала репликации был обнаружен как минимум один IBDS, расположенный в участке, свободном от нуклеосом. Эти результаты указывают на то, что структурные особенности могут рассматриваться как характерные черты точек начала репликации у млекопитающих, следовательно, последние могут быть идентифицированы и охарактеризованы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: участки внутренних изгибов ДНК, точки начала репликации ДНК, амплифициро-ванный домен гена AMPD2 млекопитающих.
Описание структурных особенностей ДНК, способных предопределить потенциальную возможность использования данного участка для начала синтеза ДНК, является чрезвычайно интересной областью исследований. Консенсус-ная нуклеотидная последовательность сайтов инициации репликации ДНК у прокариот [1] и низших эукариот, включая БассНаготусез сеге-\isae [2, 3], была определена несколько лет назад. Однако идентификация сайтов начала репликации в клетках млекопитающих остается
Принятые сокращения: 1ВВ8 — участки внутренних изгибов ДНК; МБЯ — участок, свободный от нуклеосом; п.н. — пары нуклеотидов.
* Адресат для корреспонденции.
сложной и противоречивой задачей [4—6]. Несмотря на сложность выявления нуклеотидной последовательности, соответствующей точке начала репликации, в геноме млекопитающих, ученые сошлись во мнении, что синтез ДНК происходит в неслучайных местах [7].
Некоторые свойства ДНК, в том числе особенности ее вторичной структуры, могут играть определяющую роль в транскрипции [8], рекомбинации [9, 10] и репликации [11—18] ДНК эу-кариот, а также служить детерминантами участков ДНК, ассоциированных с ядерным матрик-сом (MARs), вовлеченных в процесс инициации репликации [19—24]. Внутренние изгибы ДНК, ассоциированные с гомополимерными А-трак-тами [12, 13, 15, 16, 25] и участками, свободны-
4
49
ми от нуклеосом (NFR) [26], могут рассматриваться в качестве характерной черты точек начала репликации ДНК эукариот. Недавно было показано, что у дрожжей S. cerevisae локальное распределение нуклеосом важно для выбора точки начала репликации и ее функционирования [27]. У двукрылых Rhynchosciara americana [13] и Drosophila melanogaster [15] картирование участков внутренних изгибов ДНК, расположенных на амплифицированных в процессе развития участках, связано с транскрипцией [11, 28] и инициацией точек начала репликации. Было показано, что в клетках млекопитающих участки изгибов необходимы для инициации репликации участка DHFR [12]. По результатам первоначального анализа они были картированы недалеко от точек начала репликации OÚGNAI3 и oriB в амплифицированном участке AMPD2 в фибробластах легкого китайского хомячка [16].
В настоящей работе мы охарактеризовали структуру точек инициации репликации в амп-лифицированном сегменте AMPD2, идентифицировали нуклеотиды в центре 11 сайтов внутренних изгибов ДНК, проанализировали геометрические параметры этих сайтов, смоделировали их двумерную структуру и оценили расположение этих сайтов относительно NFR амп-лифицированного сегмента.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Геометрические параметры и моделирование фрагмента ДНК. Для картирования сайтов внутренних изгибов ДНК, имеющих отношение к точкам начала репликации onGNAI3, oriC, oriB и oriA, последовательность амплифицированного домена AMPD2 была проанализирована при помощи программного обеспечения Map15a, как было описано ранее [16]. Мы проанализировали следующие геометрические параметры рассматриваемых изгибов: 1) ENDS-соотношение — отношение контурной длины оси фрагмента спирали к наименьшему расстоянию между концами фрагмента; 2) угол поворота (twist angle) — горизонтальную ротацию двух последовательных пар оснований друг относительно друга; 3) угол разворачивания (roll angle), определяющий степень развернутости оснований относительно большой оси пары. Эти параметры основаны на модели «клина», созданной Трифоновым [29], и рассчитывались для окна шириной 120 п.н. с шагом в 10 п.н. Для каждого из рассматриваемых участков изгиба были построены двумерные проекции трехмерной структуры при помощи программного обеспечения 3D15m1 с
использованием алгоритма Экдаля и Андерсона [30].
In silico анализ расположения нуклеосом. Для
предсказания расположения нуклеосом и выявления NFR мы проанализировали фрагменты длиной 6000 п.н. вокруг каждой из изучаемых точек начала репликации. Целый фрагмент длиной 64 000 п.н. был проанализирован он-лайн при помощи программного обеспечения NuPoP (Nucleosome Positioning Prediction software) [31].
Препараты ДНК. Фрагменты ДНК из полигенного локуса AMPD2 были клонированы в космиды и/или плазмиды, любезно предоставленные д-ром Мишель Дебатисс (Институт Кюри, Париж, Франция). Точки начала репликации oriGNAI3, oriC, oriB и oriA полигенного амп-лифицированного домена AMPD2 были описаны ранее [23, 32, 33]. Рекомбинантными векторами трансформировали термокомпетентные клетки Escherichia coli штамма DH5-a [34], ДНК очищали методом CTAB [35]. Эти векторы затем использовались в качестве матриц для последующих ПЦР для анализа при помощи метода циклической перестановки.
Клонирование фрагментов ДНК. Последовательности ДНК, отобранные по результатам компьютерного анализа, были обозначены как b1—b11 в соответствии с анализируемой точкой начала репликации. Фрагменты, длина которых не превышала 150 п.н., амплифицировали с использованием прайм еров, представленных в табл. 1. Дизайн праймеров осуществляли при помощи программного обеспечения FastPCR®, версия 4.0.27 [36]. Реакционная смесь для ПЦР содержала 1 х буфер для Taq ДНК-полимеразы; 2,5 мМ dNTPs; 0,6 мМ MgCl2; по 25 мМ прямого и обратного праймеров; 50 нг ДНК матрицы и 1 U Taq ДНК-полимеразы («Invitrogen», США) в объеме 15 мкл. ПЦР проводили при следующих условиях: предварительная денатурация при 94° в течение 5 мин, сопровождающаяся 25 циклами, чередующими денатурацию при 94° в течение 1 мин, отжиг при специфичной для каждого праймера температуре в течение 1 мин и достройку при 72° в течение 1 мин. На заключительном этапе проводили инкубацию при 72° в течение 30 мин. Амплифицированные фрагменты анализировали в ПААГ без добавления бромистого этидия согласно протоколу, описанному ранее [16]. Для оценки степени задержки в геле для каждого фрагмента ДНК вычисляли параметр R, соответствующий отношению наблюдаемой длины фрагмента к его реальной длине. Значения R-параметра между 0,90 и 1,10 указывали на отсутствие изменений в подвижности фрагмента; увеличение R-параметра >1,11 указывало на снижение подвижности, а значение
ниже 0,90 свидетельствовало об увеличении подвижности относительно ожидаемой подвижности для фрагмента данного размера [9, 11]. 11 амплифицированных фрагментов были также клонированы в векторы системы pGEM-T Easy Vector System («Promega», США). Наличие встроек подтверждали секвенированием с использованием набора DYEnamicTM ET Terminator Kits («Amersham Biosciences», Австрия) с универсальными прямым и обратным праймерами M13 при помощи MegaBACE 1.000 [37].
Анализ методом циклической перестановки. Для анализа методом циклической перестановки фрагменты, клонированные в вектор pGEM-T Easy, амплифицировали при помощи ПЦР, как описано выше. Программа амплификации включала предварительный цикл денатурации
при 94° в течение 10 мин, за которым следовало 25 циклов чередования денатурации при 94° в течение 1 мин, отжига при 60° в течение 1 мин и достройки при 72° в течение 1 мин, и заключительный этап 10 мин при 72°. Получившиеся ПЦР-продукты расщепляли рестриктазами XbaI и Sali согласно протоколу производителя. Сайты узнавания для этих ферментов были включены в каждый из праймеров для последующего клонирования. Полученные фрагменты клонировали в вектор pBendBlue, содержащий полилинкер (Multiple Cloning Site) длиной 121 п.н., который перекрывает центральный участок, содержащий сайты XbaI и Sali [38]. Для получения панели измененных фрагментов ДНК, отличающихся по положению встройки относительно концов фрагмента, полученные конструкции
Таблица 1. Последовательности I
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.