БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 2, с. 210-220
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 573.3
ЛИНЕЙНЫЕ КЛАСТЕР Ы ИЗ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА В КВАЗИНЕМАТИЧЕСКИХ СЛОЯХ ЧАСТИЦ ЖИДКОКРИ СТАЛЛИЧЕСКИХ ДИСПЕРСИЙ ДНК
© 2013 г. Ю.М. Евдокимов, Э.В. Штыкова*, В.И. Салянов, С.Г. Скуридин
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Pоссийской академии наук, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32;
*
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт кристаллографии им. А .В. Шубникова Pоссийской академии наук, 119333, Москва, Ленинский просп., 59;
E-mail: yevdokim @eimb. ru Поступила в p едакцию 03.07.12 г.
Ра ссмотрено действие наночастиц золота малого размера (~ 2 нм) на частицы холестерических жидкокристаллических дисперсий, сформированные из двухцепочечных молекул ДНК. Показано, что наночастицы золота индуцируют два разных процесса: переход холестерической структуры частиц дисперсии в нематическую, сопровождаемый быстрым уменьшением амплитуды аномальной полосы в спектре кругового дихроизма, и формирование ансамблей из наночастиц золота, сопровождаемое развитием и смещением полосы поверхностного плаз-монного резонанса. Появление этой полосы проанализировано с учетом двух разных моделей формирования ансамблей из наночастиц золота. Методом малоуглового рентгеновского р ас-сеяния проведен структурный анализ фаз, сформированных из частиц холестерических жидкокристаллических дисперсий ДНК, обработанных наночастицами золота, что позволило доказать образование линейных кластеров из наночастиц золота в «свободном пространстве» между молекулами ДНК, фиксированными в квазинематических слоях частиц жидкокристаллической дисперсии. Высказано предположение о возможной связи между формированием линейных кластеров из наночастиц золота между молекулами ДНК, упорядоченными в пространственной структуре квазинематических слоев, и токсичностью этих наночастиц.
Ключевые слова: жидкокристаллические дисперсии ДНК, наночастицы золота, круговой дихроизм, поверхностный плазмонный резонанс, малоугловое рентгеновское рассеяние, цитотоксичность наночастиц.
Известно, что имманентным свойством наночастиц металлов и окислов металлов является наличие специфических, зависящих от размера, свойств. Эти свойства наночастиц заметно отличаются от свойств, характерных для «массивного» образца исходного материала. Один из наиболее ярких примеров, иллюстрирующий существование таких различий - наноразмерные частицы золота, используемые как в научных, так и пр икладных целях [1]. Хотя цитотоксичность наночастиц золота in vitro и in vivo была исследована несколькими исследовательскими группами, инфор мация о биологических эффектах, вызываемых наночастицами золота, достаточно противоречива [2,3]. Не исключено, что
Сокращения: ХЖКД - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия, Нано-Au - наночастицы золота, ПЭГ -полиэтиленгликоль, КД - круговой дихроизм, МУР -малоугловое рентгеновское рассеяние, УФ-область спектра - ультрафиолетовая область спектра, ППР - поверхностный плазмонный резонанс.
это связано с тем, что действие наночастиц было исследовано в разных биологических системах, и в этом случае сопоставление механизмов их действия - сложная проблема.
Одной из структур, моделирующей особенности супрамолекулярной о рганизации ДНК в составе биологических объектов, являются, как известно [4], частицы холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК. Действительно, жидкокристаллическая пр ир ода этих частиц отражает некоторые специфические свойства, присущие хромосомам простейших организмов (напр имер, хромосомам Бшойа§е1-1а1а и т.д., а также ДНК-содержащим бактериофагам) [5-7]. Следовательно, ХЖКД ДНК является системой, интересной как с нанотех-нологической [4], так и биотехнологической точек зрения.
Цель настоящей работы со стояла не только в анализе взаимодействия наночастиц золота с двухцепочными молекулами ДНК, фиксирован-
ными в пространственной структуре частиц ХЖКД, образующейся в результате их фазового исключения из водно-полимерных растворов, но и в уточнении способа расположения нано-частиц золота в частицах этой дисперсии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали раствор коллоидного золота (гидрозоль), содержащий квазиметаллические на-ночастицы золота (Нано-Au) размером 2-3 нм (^Нано-Au = 7,4-1014 частиц/мл), синтезированные, как описано в работе [8].
Наночастицы золота несли отрицательный
заряд, их ^-потенциал составлял--18 ± 7 мВ
(сразу после синтеза), -25 ± 5 мВ спустя 2 дня после синтеза и -38 ± 5 мВ спустя 9 месяцев после синтеза.
И сходный раствор наночастиц хр анили в холодильнике при 4°С в светонепроницаемом контейнере и использовали через 2,5 месяца после синтеза.
Использовали дополнительно очищенный от примесей и деполимеризованный препарат ДНК из тимуса кр упного рогатого скота (Sigma, С ША) с молекулярной массой (0,3-0,7)-106 Да.
Концентрацию ДНК в водно-солевых растворах определяли спектрофотометрически, пользуясь известным значением молярного коэффициента поглощения (етах = 6600 М-1см-1).
Препарат полиэтиленгликоля (ПЭГ; Serva, Гер мания; молекуляр ная масса 4000 Да) использовали без дополнительной очистки.
Спектры поглощения регистрировали на спектр офотометре Сагу 100 Scan (Varian, США), а спектры кругового дихроизма (КД) - на портативном дихрометр е С КД-2. С пектры КД представляли в виде зависимости разности ин-тенсивностей поглощения лево- и правополя-ризованного света (ДА = (A L - А R)) от длины волны (X).
ХЖКД ДНК в ПЭГ-содержащих водно-со -левых растворах готовили в соответствии с методикой, описанной ранее [4], добавляли разные объемы исходного гидрозоля золота, а затем регистрировали спектры КД и спектры поглощения полученных смесей.
О садки жидкокристаллических фаз (~ 3 мг), полученные при помощи низкоскоростного центрифугирования частиц ХЖКД ДНК, обработанных наночастицами золота ((ДНК + Аи-1) -C
Нано-Au Нано-Au
мер ения проводили методом традиционного малоуглового рентгеновского рассеяния (МУР) на усовершенствованном лабораторном дифракто-метре АМУР-К (разработка С КБ Института кристаллогр афии РАН, Москва) при фиксиро -ванной длине волны излучения X, равной 0,1542 нм, с применением геометрии Кратки [9] в области значений волновых векторов в интервале 0,12 < 5 < 10,0 нм-1 (где: 5 = 4л8ш9А, 29 - угол рассеяния). Полученные экспер имен-тальные данные были нормированы на интенсивность падающего пучка, после чего в них вводили поправку на коллимационные искажения в соответствии со стандартной пр оцедурой [10].
Первичную обработку полученных экспериментальных данных МУР проводили при помощи пр ограммы Р^МИБ, а анализ брэггов-ских пиков на кривых малоуглового рассеяния -при помощи программ РЕАК [11]. Р азмер кристаллитов Ь определяли из полуширины максимума интенсивности первого пика, соответствующего углу рассеяния 29:
L =
X
(1)
p^ose/
степень разупорядоченности в полимер ной системе Д/^1 определяли как:
(2)
Д/d, =
=1 vM
1 п X '
= 0,066-1014 частиц/мл, (ДНК + Аи-5) -= 0,33-1014 частиц/мл и (ДнК + Аи-10) -= 0,66-1014 частиц/мл), были использованы для рентгеноструктурного анализа. Из-
Нано-Au
где: й?1 = 271/51 - пер иод структуры (межплоскостное расстояние), в5 - полная ширина на полувысоте максимума интенсивности рассеяния (в радианах), наблюдаемого на угле рассеяния 291, соответствующего волновому вектору 51, а Д - среднеквадратичное отклонение от расстояния между ближайшими регулярно упакованными структурными мотивами.
Одной из основных концепций, используемых при анализе малоуглового рассеяния, является концепция «матрица-частица». В большинстве практически важных приложений рассеивающий объект можно представить как со -вокупность частиц, внедренных в матрицу, причем рассеивающая способность частиц и матрицы отличается (частицы имеют контраст по отношению к матрице). Рассеивающая способность частиц для рентгеновских лучей описывается распределением электронной плотности р(г). В предположении, что матрица имеет постоянную электронную плотность р5, эффективная рассеивающая способность частицы определяется разностью Др(г) = р(г) - р5. Амплитуда
Рис. 1. Спектры КД ХЖКД ДНК, обработанной наночастицами золота: 1 - СНано-Аи = 0; 2 - СНано-Аи = 0,07-1014 частиц/мл; 3 - СНано-Аи = 0,26-1014 частиц/мл; 4 - СНано-Аи = 0,82-1014 частиц/мл. (Время обработки XЖКД ДНК наночастицами золота -3 ч.) С днк = 9 мкг/мл; СПЭГ = 150 мг/мл; 0,27 М МаС1 + 1,78-10-3 М Ма+-фосфатный буфер; АЛ = (Аь - Ае)-10-3 опт. ед.; Ь = 1 см. На врезке: зависимость величины АЛ 270 от концентрации наночастиц золота в растворе. Сднк = 20 мкг/мл; Спэг = 170 мг/мл; 0,3 М МаС1 + 2-10-3 М Ма+-фосфатный буфер; АЛ = (Аь - А^-Ю-6 опт. ед.; Ь = 1 см.
упр угого р а ссеяния от одной частицы в матр ице опр еделяется пр еобр азованием Фур ье:
Л (s) = J [p(r)] = ]Др(г)ехр (isr)dr,
(3)
где вектор рассеяния 8 есть разность между волновыми вектор ами ра ссеянной, к1, и падающей, к0, волн.
В экспер именте измер яется не амплитуда, а интенсивность р а ссеяния, I (8) = А (8)А*(8), ко-тор ая пр опор циональна числу фотонов, р ассе-янных в напр авлении 8.
П р и помощи фур ье-пр еобр азования интенсивности р ассеяния 1(л) можно опр еделить функцию р а спр еделения по р а сстояниям:
r2 Г sm sr p(r) = — Js27(s)-dr.
(4)
sr
0
Эта функция, помимо инфор мации об ани-зометр ии ча стицы, позволяет оценивать максимальный р азмер D тах из условия р(г) = 0 пр и
r > Dтах.
В настоящей работе величину р(г) рассчитывали не прямым интегр ир ованием интенсивности (что пр иводит к сильным эффектам об-
p ыва), а пр и помощи так называемого косвенного фур ье-пр еобр азования и пр огр аммы GNOM [12].
Функция p(r) была использована для определения максимальных р азмер ов рассеивающих объектов D max, а анализ пр офиля функции позволил оценить основные характеристические размеры структур, присутствующих в рассеивающем объекте [10].
Моделирование строения ансамблей наночастиц золота в ХЖКД ДНК пр оводили пр и помощи пр огр аммы MASSHA [13], а вычисление теоретического рассеяния от модельных структур проводили,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.