ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 11, с. 1477-1485
^ ОБЩАЯ
ГЕНЕТИКА
УДК 576.3:577.17:577.218:599.323.4
ЛИНИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЭКСТРАЭМБРИОНАЛЬНОЙ ЭНДОДЕРМЫ ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК РОДА Microtus
© 2008 г. A. И. Шевченко1, В. В. Демина1, Н. А. Мазурок1, А. И. Железова1, Я. Р. Ефремов1, А. Г. Шилов1, А. И. Шевела2, 3, А. В. Белеванцева3, В. В. Власов2, С. М. Закиян1
1 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
e-mail: zakian@bionet.nsc.ru 2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090; e-mail: vvv@nibocht.nsc.ru 3 Центр новых медицинских технологий Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск 630090; e-mail: info@cnmt.ru Поступила в редакцию 17.03.2008 г.
Из клеток морул и бластоцист обыкновенных полевок получены 28 независимых клеточных линий экстраэмбриональной эндодермы (XEN). Большинство линий клеток растут с минимальными клеточными контактами и соответствуют по морфологии XEN, описанным ранее у мыши. Кроме того, у полевок впервые получены линии XEN с нетипичной морфологией, растущие колониями. Оба типа линий XEN активно пролиферируют, сохраняют свою морфологию и кариотип на протяжении более чем 25 пассажей культивирования и экспрессируют гены, характерные для экстраэмбриональной эндодермы. Показано, что одна из двух Х-хромосом в линиях клеток XEN с кариотипом XX неактивна и ассоциирована с транскриптом гена Xist. Доказано, что неактивной хромосомой является Х-хромосома, унаследованная от отца.
В процессе дробления зиготы млекопитающих на стадии бластоцисты формируется трофоэкто-дерма и внутренние клетки, известные как внутренняя клеточная масса (ВКМ). Впоследствии ВКМ подразделяется на две клеточные популяции, а именно на примитивную эндодерму (гипо-бласт) и примитивную эктодерму (эпибласт). Из эпибласта образуются все органы зародыша и гаметы, к тому же его производные участвуют в формировании экстраэмбриональных мембран (амниона, аллантоиса, желточного мешка). Примитивная эндодерма дает начало экстраэмбриональной эндодерме, которая подразделяется на клетки париетальной и висцеральной эндодермы, участвующие в формировании желточного мешка. Клетки трофоэктодермы формируют плаценту [1].
Клетки эпибласта, клетки-предшественники экстраэмбриональной эктодермы и эндодермы могут быть выделены in vitro как культуры эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, трофоб-ластных стволовых (ТС) клеткок и клеток экстраэмбриональной эндодермы (XEN) соответственно [2]. Эти клеточные линии являются хорошей моделью для изучения процессов раннего развития млекопитающих.
Культуры клеток XEN, экспрессирующие маркеры, типичные для производных экстраэмбриональной эндодермы, получены для мыши.
Инъецированные в бластоцисты клетки ХЕК мыши дают вклад исключительно во внезародыше-вые органы, которые формируются из клеток экстраэмбриональной эндодермы [3].
Известно, что в раннем эмбриогенезе у самок млекопитающих на стадии двух клеток начинается процесс инактивации, при котором одна из двух Х-хромосом становится транскрипционно неактивной. На стадии двух клеток происходит им-принтированная инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца, которая затем сохраняется в экстраэмбриональных тканях [4]. В клетках эпибласта сначала происходит реактивация Х-хромосомы отцовского происхождения, а затем случайная инактивация либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. У самок межвидовых гибридов обыкновенных полевок случайная инактивация Х-хромосомы нарушена: Х-хромосома полевки ЫкгоШз атуаШ предпочтительно остается активной, тогда как Х-хромосомы трех других близкородственных видов преимущественно инактивируются [5-7].
Целью настоящей работы являлось получение и характеристика линий клеток экстраэмбриональной эндодермы из эмбрионов разных видов и межвидовых гибридов обыкновенных полевок, изучение экспрессии генов, характерных для дан-
ного типа клеток, и особенностей протекания в них процесса инактивации Х-хромосомы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. В работе использовали животных двух близкородственных видов обыкновенных полевок подрода Microtus (Microtus, Arvicolidae): M. arvalis и M. rossiaemeridionalis. Животных, отловленных в природных популяциях, содержали и размножали в виварии Института цитологии и генетики СО РАН.
Получение эмбрионов. Эмбрионов полевок получали от внутри- и межвидовых скрещиваний полевок M. rossiaemeridionalis. На 3.5 сут после оплодотворения морулы и бластоцисты (ранние, средние и поздние) вымывали из яйцевода и матки средой Виттена. Блестящую оболочку (zona pellucida) снимали средой Тироде рН 2.5-2.7 (1.5 мин). Бластоцисты и морулы сажали в лунки 4-луночных плат и через 3-5 сут (в зависимости от скорости роста) выделяли механически внутреннюю клеточную массу (ВКМ) в фосфатном солевом буфере (DPBS, pH 7.2) без ионов кальция и магния или в ростовой среде, механически разделяли микрокапиллярами с оплавленными концами на отдельные куски и клетки, затем переносили в лунку 4-луночного плата с фидером и питательной средой, предназначенной для культивирования клеток XEN.
Питающий (фидерный) слой клеток. Для получения фидера использовали первичные эмбриональные фибробласты мыши линии CBA и полевки M. rossiaemeridionalis, полученные из 13-14-суточных эмбрионов. Для культивирования эмбриональных фибробластов использовали среды аМЕМ и DMEM (GIBCO/BRL) либо их комбинацию, в среду добавляли 10%-ную эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота (FCS, GIBCO/BRL) и раствор антибиотиков пенициллина и стрептомицина (GIBCO/BRL) в концентрации 50 мкг/мл каждый. Для остановки митотических делений клеток эмбриональных фибробластов в среду добавляли митомицин С (Sigma) на 2 ч с конечной концентрацией 10 мкг/мл, после чего клетки отмывали 3 раза солевым раствором DPBS. Клетки фидера высевали в 4-луночные плата приблизительно по 150000 клеток на одну лунку. Плата предварительно обрабатывали 0.1%-ным раствором желатина в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
Получение и культивирование клеток XEN. Клетки ВКМ бластоцист культивировали при 37°С в атмосфере с 5%-ным содержанием CO2, на слое фидера, используя либо среду "Игла" в модификации Дюльбекко с высоким (4500 мг/л) содержанием глюкозы (DMEM, GIBCO/BRL) без пирувата натрия, либо смешанную среду DMEM/F-12 (1 : 1,
GIBCO/BRL), обогащенные 15% FCS (GIBCO/BRL). Культуральные среды содержали фактор, инги-бирующий лейкемию (LIF, GIBCO/BRL) мыши, конечная концентрация 1000 ед./мл, 1мМ L-глю-тамин (GIBCO/BRL), однократный раствор несущественных аминокислот (GIBCO/BRL), 0.1 мМ 2-меркаптоэтанол (Sigma), пенициллин (50 ед./мл, GIBCO/BRL), стрептомицин (50 мкг/мл, GIBCO/BRL). Среди выросших клеток отбирали XEN-подобные по морфологическим критериям. Островки клеток механически выделяли в среде или DPBS, первые колонии 1-2-го пассажа разрывали микрокапиллярами с оплавленными концами на отдельные куски и клетки и переносили в новую лунку. С 3-4-го пассажа для дезагрегации клеток использовали раствор 0.025 %-ный трипсин-0.037%-ную двунатрие-вую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)-2%-ную сыворотку цыпленка. При культивировании не использовали фидер, поверхность лунок перед посадкой клеток обрабатывали 0.1%-ным желатином (Sigma), из ростовой среды исключали фактор LIF и 2-меркаптоэтанол.
Гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы. Из лунки отсасывали среду, промывали 1-2 раза буфером DPBS, высушивали на воздухе в течение 15-20 мин. Для выявления активности щелочной фосфатазы использовали набор реактивов фирмы "Sigma".
Цитогенетический анализ. Гипотонию и фиксацию клеток, а также дифференциальное окрашивание хромосом проводили, как описано ранее [8], время гипотонии клеток XEN составляло 60 мин.
Получение опухолей. 8-9 млн. клеток XEN в 150 мкл среды без сыворотки и ростовых факторов вводили подкожно в область шеи между ушами бестимусным мышам линии Balb/c -nu.
Выделение РНК, обратная транскрипция, ПЦР. РНК выделяли из суспензии клеток XEN с помощью TRI REAGENT (Sigma) по инструкции фирмы-производителя, кДНК синтезировали с тотальной РНК обратной транскриптазой SuperScriptIII (Invitrogene). Синтез кДНК праймирова-ли случайными олигонуклеотидами. Последовательности праймеров, использованные при ПЦР, приведены в табл. 1. Для каждой пары праймеров проводили реакцию негативного контроля, в которой в качестве матрицы использовали реакционную смесь, содержащую все компоненты, необходимые для синтеза кДНК, за исключением обратной транскриптазы. ПЦР продукты анализировали на 2%-ном агарозном геле и секвенировали для подтверждения гомологии их последовательности соответствующим генам мыши. Нуклеотидные последовательности зарегистрированы в базе данных EMBL, регистрационные номера указаны в табл. 1.
РНК и ДНК FISH, анализ плоидности линий, иммуноокрашивание. РНК-FISH выполняли со-
Таблица 1. Праймеры, использованные при анализе экспрессии генов в линиях клеток ХЕК обыкновенных полевок
Ген Последовательность праймера РазмерПЦР-продукта, пн ACC
ß-actin GACGGGGTCACCCACACTGT GAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG 523
Oct4 CCAAGCTGCTGAAGCAGAAGA TTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG 631 EF030115
Eomes ATTGTCCCTGGAGGTCGGTA GAAGGTCGGGTCAGGGTAAT 316 EU285608
Handl CCCCATGCTCCACGAACCC AACTCCCTTTTCCGCTTGCT 467 EU285606
Fgf2r TCTTGTTCTTCAGGGGACGATTC ATGCTTCCCACTATTTACTCCTCTG 242 DQ517964
Esrrß AGCTGCGGCTCCTTCATCAAG CTTGTACTTCTGGCGGCCTCC 543 DQ517967
Cdx2 CCACCATGTACGTGAGCTACC GACTGAGCGCTGTCCAAGTT 184 DQ517966
Pl-1 TCCAGAGAATCGAGAGGAAGT ACAACTCGGCACCTCAAGAC 383 DQ517968
Tpbp AAACAGCCACTGTGCCATTG GTAAGGTTTTATTAGTGTGAACAT 214 DQ517965
Foxa2 CCCTACGCCAATATGAACTCCATG GTTCTGCCGGTAGAAAGGGA 220 EU285609
Hnf4 GGTCAAGCTACGAGGACAGC AGAAGATGATGGCTTTGAGG 460 EU285605
Sox2 TCCATGACCAGCTCGCAGACCTAC CCCTCCCAATTCCCTTGTTTCTCT 392 EU285607
Nanog TCCATAACTTCGGGGAGGA TCACAGAGTAGTTCAGGAATA 156 EU285611
Afp ACATCGAGGAGAGCCAGGCA CCTGAGCTTGGCACAGATCC 413 EU285612
Gata6 CACCATCATCACCACCCGACCTAC CAGGGCCAGAGCACACCAAGAATC 788 EU285604
Sall4 TCACCAACGCCGTCATGTTACAGC GGTGGGCTGTGCTCGGATAAATGT 604
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.