ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 424, № 4, с. 548-550
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 612.112.94
ЛИПОПОЛИСАХАРИД ИЗ RHODOBACTER CAPSULATUS ПОДАВЛЯЕТ ДЕЙСТВИЕ ЭНДОТОКСИНА ИЗ РАЗНЫХ ХЕМОТИПОВ E. COLI НА ПРАЙМИРОВАНИЕ И АПОПТОЗ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА © 2009 г. М. Г. Винокуров, М. М. Юринская, С. В. Грачев, И. Р. Прохоренко
Представлено академиком В.А. Шуваловым 01.04.2008 г. Поступило 08.04.2008 г.
Бактериальные эндотоксины играют ключевую роль в патогенезе тяжелых грамотрицатель-ных инфекций. Попав в кровеносное русло, эндотоксины (липополисахариды, LPS) взаимодействуют с миелоидными клетками, что приводит к образованию в клеточной мембране рецепторно-го комплекса, включающего TLR4, CD14, MD2, CD11b, CD18, MyD88 и другие белки. Под действием эндотоксинов происходит активация различных путей внутриклеточной сигнализации, приводящая к изменению функциональных свойств нейтрофилов и ингибированию апоптоза этих клеток [1].
Работы по исследованию действия эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов проводятся в основном с использованием липополисахаридов S-хе-мотипа, характерного для большинства клинических изолятов E. соН [2]. Известно, что структура эндотоксинов влияет на патогенетические механизмы сепсиса, однако влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антиге-на) липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых эндотоксинами, изучено значительно меньше [3] по сравнению с эффектами, обусловленными липидом А [4]. В зависимости от структуры липида А липополисахариды могут обладать не только токсическим действием (агонисты), но и блокировать действие эндотоксинов (антагонисты) [5].
Ранее нами было показано, что LPS из Rhodo-bacter capsulatus (LPSRb.caps), обладающий антагонистическим действием, снижал эндотоксин-ин-дуцированную адгезию нейтрофилов и продукцию активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами и моноцитами и задерживал инги-
Институт биофизики клетки
Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Институт фундаментальных проблем биологии Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
бирование апоптоза нейтрофилов под действием эндотоксинов [6].
Целью настоящей работы было исследование действия LPS из Rh. capsulatus на праймирование и апоптоз нейтрофилов при действии LPS из разных хемотипов E. coli.
В работе использовали следующие вещества: среда RPMI-1640, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), пропидиум иодид (PI), HEPES, раствор Хенкса (HBSS), пенициллин, стрептомицин, дигитонин, фиколл 400, фосфатный буфер (PBS), формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), Rc-LPS from E. coli J5, Ra-LPS from E. coli EH100, S-LPS from E. coli O55:B5 ("Sigma", США), Hoechst 33258 ("Calbiochem", США). Re-LPS E. coli JM103 был изолирован из бактерий методом Галанос [7] экстракцией смесью фенол/хлороформ/петро-лейный эфир. Препараты Re-LPS были проверены на содержание белков и нуклеиновых кислот по поглощению при 260 и 280 нм [8]. LPSRb.caps. получали из фотосинтезирующих бактерий Rh. capsulatus (Российская коллекция микроорганизмов ИБФМ РАН) по модифицированной методике Кульшина [9].
Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-слой-ном градиенте фиколла-верографина (1.119 и 1.077).
При исследовании апоптоза выделенные нейтрофилы (106 клеток/мл) культивировали в среде, содержащей RPMI-1640, 1% L-глутамина, 1% пенициллина, 1% стрептомицина и 10% термоинак-тивированной ЭТС при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02, в течение 14 ч.
Апоптоз регистрировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием 1 мкг/мл флуоресцентного зонда Hoechst-33258 [6]. Жизнеспособность нейтрофилов контролировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием PI [6]. Жизнеспособность выделенных клеток составляла 98-99%, а после окончания культивирования 96-98%.
ЛИПОПОЛИСАХАРИД ИЗ RHODOBACTER CAPSULATUS
549
ХЛ, %
350 -
300 -
250 -
200 -
150 -
100 -
50 -
0
Апоптоз, % 100 г
i
K
Re
Rc
Ra
80 60 40 20 0
□ 2 ---3
lb
Re
Rc
Ra
Рис. 1. Действие разных хемотипов LPS E. coli (20 нг/мл) на праймирование нейтрофилов в отсутствие (1) и присутствии (2) LPSRbcapS K - контроль. Re-, Rc-, Ra-, S-хемотипы LPS.
Праймирование нейтрофилов разными LPS оценивали по уровню хемилюминесценции (ХЛ) в ответ на вторичный стимул fMLP [6]. Нейтрофи-лы в HBSS (1 ■ 106 клеток/мл) были праймирова-ны 20 нг/мл LPS в течение 30 мин при 37°С в присутствии 2%-ной плазмы (пул плазмы 10 здоровых доноров хранился перед использованием при -70°С). Образцы помещали в люминометр 1250 LKB (Швеция). Клетки были стимулированы с 1 мкМ fMLP в присутствии 350 мкМ люминола. Хемилюминесценцию регистрировали в течение 10 мин. Данные анализировали с помощью программы SigmaPlot.
Исследование действия различных хемотипов липополисахарида E. coli на генерацию АФК ней-трофилами показало, что все эндотоксины, независимо от их хемотипа, вызывали значительное увеличение люминолзависимой хемилюминесценции по сравнению с контролем (рис. 1, 1). Наибольшее увеличение продукции АФК нейтрофи-лами вызывал S-LPS-хемотип E. coli. Увеличение величины регистрируемой ХЛ наблюдалось в следующем ряду: контроль < Rc-LPS < Re-LPS < < Ra-LPS < S-LPS.
Ранее нами было показано, что время защитного действия LPSRbcaps. от праймирующего эффекта S-хемотипа эндотоксина составляет 5 мин [10]. По этой причине при исследовании защитного действия LPSRbcaps. от праймирующего действия разных хемотипов LPSEcoli нейтрофилы перед добавлением хемотипов инкубировали 5 мин с LPSRbcaps. Полученные результаты показали, что LPSRbcaps. отменял эндотоксин-индуцирован-ное праймирование нейтрофилов для всех исследованных хемотипов LPS (рис. 1, 2).
Рис. 2. Действие разных хемотипов LPS E. coli (100 нг/мл) на апоптоз нейтрофилов в отсутствие (1) и присутствии (2) LPSRb caps. Re-, Rc-, Ra-, S-хемотипы LPSe coli. Время культивирования нейтрофилов -14 ч. 1 - 100 нг/мл эндотоксина; 2 - последовательное действие 1 мкг/мл LPSRb caps. и 100 нг/мл эндотоксина. 3 - апоптоз нейтрофилов в присутствии 1 мкг/мл LPSRb.caps..
Величина ингибирования апоптоза под действием исследованных хемотипов эндотоксина убывает в ряду: S-LPS < Ra-LPS < Rc-LPS < Re-LPS (рис. 2). Из полученных результатов следует, что максимальное ингибирование апоптоза нейтрофилов наблюдается для хемотипа Re-LPS, состоящего только из липида А и двух остатков 2-кето-3-дезокси-Б-манно-октулозоновой кислоты (рис. 2).
LPSRbcaps. оказывает небольшое ингибирую-щее действие на апоптоз нейтрофилов. При действии 1 мкг/мл LPSRbcaps. величина ингибирования апоптоза нейтрофилов составляла около 5 % (на рис. 2 штриховая линия).
Известно, что кинетика интернализации разных хемотипов LPS коррелирует с увеличением длины цепи полисахарида в составе молекулы LPS и, как следствие, с уменьшением гидрофоб-ности эндотоксинов [11]. Однако липид А имеет меньшую скорость интернализации, чем Re-LPS и Rd-LPS. Это может быть связано с тем, что липид А, вследствие своих гидрофобных свойств, образует крупные мицеллы, которые медленнее интерна-лизуются по сравнению с хемотипами LPS, имеющими в своем составе внутренний (Re) и внешний (Rd) кор. Полученные нами результаты показали, что изменение величины хемилюминесценции в ряду: S- LPS > Ra-LPS > Re-LPS (рис. 1) коррелирует с увеличением длины цепи полисахарида исследованных хемотипов эндотоксина E. coli, что хорошо согласуется с данными работы [12].
S
S
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 424 < 4 2009
550
ВИНОКУРОВ и др.
LPSRbcaps не вызывает активации сигнальных путей (при эндотоксин-индуцированном увеличении продукции АФК нейтрофилами) с участием р38MAPK, ERK и PI-3K и не действует на сигнальные пути регуляции как р38MAPK, так и ERK-за-висимые пути регуляции апоптоза нейтрофилов [6, 13]. Эти данные указывают на то, что защитные эффекты LPS из Rh. capsulatus от действия эндотоксинов на миелоидные клетки человека связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы. Результаты проведенных экспериментов по изучению роли рецепторов в действии LPSRbcaps. показывают, что этот липополисахарид незначительно снижает экспрессию CD 14- и CD11b/CD18-рецепторов моноцитов и нейтрофилов, участвующих в доставке эндотоксинов к TLR4-рецепторам. Установлено, что LPSRbcaps. отменяет связывание эндотоксина (меченного FITC) с моноцитами. LPSRbcaps. также отменяет эн-дотоксин-обусловленную экспрессию
CD11b/CD18-рецепторов нейтрофилов [6].
Исследования работы [14] показали, что комплекс TLR4/MD-2 различает R- и S-формы LPS. В состав сахаров R-формы входят сахара внутреннего кора и внешнего кора, длина которых может быть определяющей при взаимодействии с рецепторами клеток-мишеней. С этим, вероятно, связана несколько большая величина хемилюми-несценции нейтрофилов в присутствии Rc-LPS по сравнению с Re-LPS (рис. 1).
Полученные экспериментальные результаты демонстрируют способность LPSRbcaps. снижать эффекты эндотоксина E. coli, независимо от их хемотипа, на праймирование и апоптоз нейтрофилов человека.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gioannini TL., Weiss J.P. // Immunol. Res. 2007. V. 39. P. 249-260.
2. Heinrichs D.E., Yehton J.A., Whitfield C. // Mol. Microbiol. 1998. V. 30. P. 221-232.
3. Feist W, Ulmer A.J., Musehold J. // Immunobiology. 1989. V. 179. P. 293-307.
4. Muller-Loennies S. et al. // Prog. Clin. Biol. Res. 1998. V. 397. P. 51-72.
5. Kawata T., Bristol JR., Rose J.R. // Prog. Clin. Biol. Res. 1995. V. 392. P. 499-509.
6. Винокуров М.Г., Юринская M.M., Прохоренко И.Р., Грачев С В. // Молекуляр. медицина. 2006. № 4. С. 56-62.
7. Galanos C, Luderitz O., Westphal O. // Europ. J. Bio-chem. 1969. V. 9. P. 245-249.
8. Thorne C.J.R. Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry. Amsterdam: Elsevier; North Holland, 1978. Pt. 1. P. 1-18.
9. Махнева 3.K., Вишневская T.A., Прохоренко И.Р. // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. < 4. С. 444-447.
10. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р, Юринская М.М. и др. // ДАН. 2003. Т. 393. № 2. С. 273-27
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.