научная статья по теме ЛИЗОГЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ КОНВЕРТИРУЮЩИМ БАКТЕРИОФАГОМ, КОДИРУЮЩИМ ШИГА-ТОКСИН 2, ИЗМЕНЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ, ПОВЫШАЕТ КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТЬ И УСИЛИВАЕТ ПОДВИЖНОСТЬ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ Биология

Текст научной статьи на тему «ЛИЗОГЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ КОНВЕРТИРУЮЩИМ БАКТЕРИОФАГОМ, КОДИРУЮЩИМ ШИГА-ТОКСИН 2, ИЗМЕНЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ, ПОВЫШАЕТ КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТЬ И УСИЛИВАЕТ ПОДВИЖНОСТЬ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 1, с. 60-73

= МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 578.2'21

ЛИЗОГЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ КОНВЕРТИРУЮЩИМ БАКТЕРИОФАГОМ, КОДИРУЮЩИМ ШИГА-ТОКСИН 2, ИЗМЕНЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ, ПОВЫШАЕТ КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТЬ И УСИЛИВАЕТ

ПОДВИЖНОСТЬ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ © 2010 г. L. K. Su1, C. P. Lu1, 2, Y. Wang1, D. M. Cao1, J. H. Sun1, Y. X. Yan1*

1Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, School of Agriculture and Biology,

Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China 2Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology of Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China Поступила в редакцию 22.03.2009 г.

Принята к печати 27.04.2009 г.

Конвертирующие бактериофаги, кодирующие шига-токсин 2 (Stx2), способны инфицировать и лизогенизи-ровать бактерии in vivo и in vitro, внося, таким образом, дополнительный вклад в генотипическую гетерогенность клеток-хозяев. Однако нет четких данных об изменениях в глобальной картине транскрипции, сопровождающих лизогенную инфекцию Escherichia coli. В данной работе с помощью анализа на микрочипах сравнили профили экспрессии генов в клетках E. coli MG1655, конвертированных Stx2-кодирующим фагом ФMin27(Astx::cat), с неконвертированными клетками. Конверсия фагом ФMin27(Astx::cat) прямо влияла на глобальную экспрессию генов бактерии-хозяина. Изменение уровня экспрессии установлено для 166 генов (104 с повышением и 62 со снижением уровня). Эти гены отвечают в основном за центральный метаболизм, транспорт и транскрипцию. Снижение уровня экспрессии наблюдали как для генов, участвующих в синтезе тиамина и кодирующих белки-транспортеры, так и для генов, связанных с энергетическим обеспечением бактериальной клетки (например, генов fadABDEHIJL, aceK и acnA). Повышение уровня экспрессии наблюдали для генов, вовлеченных в транспорт, синтез флагелл (fliDESTZ) и кислотоустойчивость (например, генов gadEW, hdeABD и adiY). Кроме того, обнаружено, что конверсия фагом ФMin27(Astx::cat) может изменять физиологические характеристики клетки-хозяина. По сравнению с неинфицированными клетками конвертированные клетки обладали повышенной устойчивостью при низких значениях pH и большей подвижностью при плавании по поверхности полужидкой агаризованной среды.

Ключевые слова: транскрипционный анализ, конвертирующий бактериофаг с геном шига-токсина 2, ФMin27(Astx::cat), конверсия, кислотоустойчивость, подвижность.

LYSOGENIC INFECTION OF A SHIGA TOXIN 2-CONVERTING BACTERIOPHAGE CHANGES HOST GENE EXPRESSION, ENHANCES HOST ACID RESISTANCE AND MOTILITY, by L. K. Su1, C. P. Lu1 2, Y. Wang1, D. M. Cao1, J. H. Sun1, and Y. X. Yan1* ^Shanghai Key Laboratory of \feterinary Biotechnology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China, *e-mail: yanyaxian@sj-tu.edu.cn; 2Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology of Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). Shiga toxin 2 (Stx2)-converting bacteriophages can infect and lysog-enize other bacteria in vivo and in vitro, and, thus, contribute to a genotypic heterogeneity of infected host. However, the global transcription patterns accompanying the lysogenic infection of E. coli host have not been clearly resolved. In this study, gene expression profiles of Stx2 phage ®Min27(Astx::cat) converted and native E. coli MG1655 hosts were compared using microarray assay. The OMin27(Astx::cat) conversion had a direct effect on the global expression of bacterial host genes as 166 genes were found to be differentially expressed (104 up-regulated and 62 down-regulated). These genes were predominantly responsible for bacterial central metabolism, transport and transcription. It was shown that in addition to the down-regulation of genes involved in synthesis of thiamine and protein transporters, expression of genes associated with bacterial energy production (e.g., fadABDEHIJL, aceK, and acnA) was also suppressed. Conversely, most up-regulated genes were transport genes, flagellar synthesis genes (fliDESTZ), and acid resistance genes (e.g., gadEW, hdeABD, and adiY). Futhermore, conversion of OMin27(Astx::cat) was shown to change physiological properties of the host cell. In comparison with the uninfected cells the converted bacteria host had increased acid tolerance and promoted swimming motility on a semisolid agar surface.

Key words: transcriptional analysis, Shiga toxin 2-converting bacteriophage, OMin27(Astx::cat), conversion, acid tolerance, motility.

* Эл. почта: yanyaxian@sjtu.edu.cn

Инфекция продуцирующими шига-токсин (Stx) штаммами E. coli (STEC) представляет собой серьезную проблему, поскольку исход ее может быть летальным [1]. Гены шига-токсина — это ключевые детерминанты вирулентности, которые осложняют тяжесть протекания бактериемии и могут распространяться среди бактерий-хозяев Stx-кодирующи-ми фагами [2—4]. В течение многих лет исследуют возможную роль Stx-кодирующих фагов в развитии заболеваний пищевого происхождения, при которых вызванные STEC инфекцией симптомы могут варьировать от диареи до угрожающего жизни гемолитического уремического синдрома [5, 6]. В предыдущих исследованиях показано, что за исключением генов, определяющих кор-функцию, Stx-кодирующие фаги гетерогенны и содержат большое число открытых рамок считывания, но функции кодируемых ими белков пока остаются неизвестными [7]. Кроме того, такие фаги различаются по морфологии, подтипам токсина и кругу хозяев [8]. У Stx-кодирующих фагов два вида жизненного цикла: литический и лизогенный [9]. Инфекция умеренным по природе фагом обычно приводит к лизогении; при этом фаговый геном интегрируется в хромосому бактериальной клетки-хозяина и реплицируется в виде "покоящегося" профа-га. Лизогенная конверсия Stx-кодирующими фагами обусловливает появление новых патогенных штаммов бактерий, поскольку она способствует распространению дополнительных последовательностей ДНК и повышает частоту рекомбинации в хозяйской бактериальной клетке [10]. Переход от лизогенного к литическому жизненному циклу стимулируют агенты, которые повреждают бактериальную ДНК или препятствуют ее репликации; к этим агентам можно отнести ультрафиолет, перекись водорода и такие антибиотики, как митомицин С [11—13].

Лизогенная инфекция Stx-кодирующими фагами представляет собой сложный процесс: от узнавания и адсорбции фага на специфическом рецепторе наружной мембраны с последующим высвобождением из капсида фаговой ДНК до ее интегрирования в хромосому клетки-хозяина посредством сайт-специфической рекомбинации [14]. Процесс лизо-генной инфекции включает в себя сложную регуляцию экспрессии генов и белок-белковых взаимодействий, происходящих между фагом и хозяином. Например, для сайт-специфической рекомбинации Stx-кодирующим фагам требуется как интегра-за, так и кодируемый хозяйским геномом фактор интеграции IHF (integration host factor), который необходим для интеграции в хромосому бактериальной клетки [15]. До сих пор регуляцию и функцию генов анализировали, используя в основном пошаговый метод исследования индивидуальных генов. Высокопроизводительный метод с использованием ДНК-микрочипов позволяет в одном ги-бридизационном эксперименте измерить одновременно уровень экспрессии тысяч генов [16]. В работах последних лет технология ДНК-микрочипов с

успехом применялась для исследования экспрессии генов в ходе ответа бактериальной клетки-хозяина на индукцию латентного фага X [17], глобальной экспрессии генов профага в клетках E. coli O157:H7 штамма EDL933 в ответ на обработку норфлокса-цином [18], а также изменений, происходящих в процессе транскрипции, при лизогенной инфекции нитчатым фагом M13 [19]. Так как о глобальном воздействии Stx-кодирующих профагов на физиологию клеток E. coli на уровне транскрипции до сих пор не сообщалось, мы исследовали влияние Stx2-кодирующего фага ФМт27(^х::са^ на транскрип-том клеток E. coli MG1655, используя для этого технологию ДНК-микрочипов. Фаг ФМт27 представляет собой конвертирующий Stx2-кодирующий фаг, индуцированный из штамма E. coli O157:H7, который выделен в Китае из фекалий страдавшего диареей поросенка [20]. ДНК этого фага (номер в GenBank: EU311208) имеет 91% гомологии с ДНК Stx2-кодирующего фага 933W, исключение составляют три гена (O, P и ORF31) в репликативной области фагового генома. Штамм E. coli MG1655 выбран нами в качестве модели хозяйской клетки, поскольку в нем нет генов, идентичных генам фага ФМт27, а E. coli широко используется как модельная система для изучения многих аспектов физиологии бактерий и фундаментальной генетики [21].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штаммы бактерий, Stx2-кодируюш,ий фаг и среды.

Фаг ФМт27(Д81х::са^ является производным Stx2-кодирующего фага ФМт27, в котором ген stx2 прерван вставкой гена хлорамфениколацетилтрансфе-разы (cat, 1.3 т.п.н.) с помощью рекомбиназной системы Red [20]. Лабораторный штамм E. coli K-12 MG1655 использовали для получения лизогена.

Бактерии культивировали в жидкой среде Лурия— Бертани (LB; 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) или агаризованной среде LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl и 1.5 % агар (вес/объем)); при селекции клеток, несущих лизогенный фаг ФMin27(Дstx::cat), в среду добавляли хлорамфеникол (Cm) в концентрации 25 мкг/мл.

Лизогенизация клеток MG1655 фагом ФМт27 (Astx::cat). Лизоген получали, используя метод Schmidt et al. с небольшими модификациями [22]. Клетки со множественностью заражения 0.1 получали по следующей схеме. Сначала в течение 4 ч при 37°C инкубировали 100 мкл препарата фага ФMin27(Дstx::cat) (приблизительно 109 БОЕ/мл) в 1 мл ночной культуры штамма E. coli MG1655 (приблизительно 109 КОЕ/мл), затем для селективного обогащения полученной среды лизогеном добавляли 4 мл жидкой среды LB, содержащей 25 мкг/мл Cm, и инкубировали еще 24 ч при 37°C при покачивании (200 об/мин). Бактерии собирали центрифугированием и переносили на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 25 мкг/мл Cm. Выросшие в течение

ночи колонии анализировали на лизогению путем ПЦР-ам

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»