ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 592-599
УДК 581.1:577:352.3
ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОРГАНИЗАЦИЯ АППАРАТА ТРАНСЛЯЦИИ В МЕМБРАНАХ МИТОХОНДРИЙ Astasia longa
© 2004 г. И. И. Филиппович, Н. Ю. Опарина
Институт биохимии им. АН. Баха Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 22.07.2003 г.
В изолированных мембранах митохондрий Astasia longa обнаружены субструктуры в виде больших и малых колец со средними диаметрами 1.30 и 0.35 мкм и толщиной колец 0.08 и 0.03 мкм соответственно. Такие субструктуры выделены из мембран с помощью обработки их протеолитическими ферментами (протеиназа К, трипсин), а также солюбилизацией липидов Тритоном X-100. После де-протеинизации, удаляющей образующий эти субструктуры поверхностный материал, обнаруживаются кольцевые полирибосомы с соответствующими исходным кольцевым субструктурам величинами диаметров. Полирибосомы идентифицированы по морфологическому облику, позитивной ок-рашиваемости уранилацетатом, способности к ингибируемому хлорамфениколом включению 14С-аминокислот в полипептиды и по данным определения величин плавучей плотности при центрифугировании выделенных фракций в градиенте плотности CsCl. Сделан вывод, что находящийся в мембранах митохондрий A. longa аппарат трансляции организован так же, как в мембранах хлоро-пластов и цианобактерий, а именно, существующие в мембранах большие и малые кольцевые полирибосомы находятся внутри формирующихся на них субструктур той же формы.
Astasia longa - митохондрии - энергопреобразующие мембраны - полирибосомы
Вопрос о локализации рибосом в митохондриях привлекал внимание исследователей еще с середины 60-х годов прошлого столетия. В результате электронно-микроскопических исследований, проведенных на ультратонких тканевых срезах ряда объектов, были получены данные, указывающие на тесный контакт рибосом с внутренними митохондриальными мембранами. В ранних работах полагали, что они расположены на поверхности мембран и, в основном, примыкают к тем из них, которые находятся преимущественно в периферической области митохондрий [1-8]. В той же области концентрировались и но-восинтезированные РНК [9, 10]. Эти сведения подкреплялись полученными в ту пору указаниями на зависимость митохондриального белкового синтеза от структурно-функционального состояния внутренних мембран митохондрий [11].
Наряду с этими наблюдениями были получены сведения, указывающие на отличие организации митохондриального аппарата трансляции от имеющей место в случае шероховатого эндоплазма-тического ретикулума, у которого полирибосомы находятся на поверхности мембран. Отмечалась
Адрес для корреспонденции: Филиппович Ирина Иосифовна. 119071 Москва, Ленинский проспект, 33. Институт биохимии РАН. Факс: 07 (095) 958-10-70; электронная почта: inbio@glas.apc.org
особая прочность связи рибосом с митохондриальными мембранами, что позволило Ыппапе с сотр. в начале 70-х годов высказать предположение о том, что рибосомы могут быть составной частью митохондриальных мембран [11]. На специфику организации аппаратов транскрипции и трансляции, связанных с митохондриальными мембранами указывали также и другие исследователи [12, 13].
Рассмотрение рибосом митохондрий в качестве составной части внутренних мембран этих ор-ганелл согласуется с недавно полученными наблюдениями о том, что рибосомы не освобождаются из митохондриальных мембран печени быка при действии пуромицина, а часть из них не освобождается и при действии Тритона Х-100. На этом основании высказано предположение, что рибосомы могут быть ассоциированы с находящимися в мембранах большими олигомерными комплексами [14]. Таким образом, в отличие от ранних представлений теперь все более подкрепляется мнение, что рибосомы находятся внутри митохондриальных мембран.
В последние годы тема локализации и пространственной организации белоксинтезирующего аппарата в клеточных органеллах вновь привлекает внимание в связи с установлением присутствия полирибосом внутри мембран хлоропластов и с постулированием модели их пространственной организации. Согласно ей, в зрелых хлоропластах
аппарат трансляции представлен многокольцевыми полирибосомами, каждый кольцевой фрагмент которых находится внутри маргинальной части тилакоидов гран [15]. Полирибосомы присутствуют в мембранах хлоропластов практически на протяжении всего их биогенеза. В этиохло-ропластах они находятся в первичных мембранах, где образуются и служат основой развития мембранной системы зрелых хлоропластов [16]. Такая структурная организация, когда полирибосомы находятся не на поверхности, а внутри мембран, очевидно, свойственна не только белоксинтези-рующему аппарату хлоропластов высших растений, а, по-видимому, является особенностью организации этого аппарата, связанного вообще с фотосинтетическими мембранами. Об этом свидетельствуют результаты исследований локализации и организации мембранно-связанного аппарата трансляции в цианобактерии Phormidium laminosum, у которой нет тилакоидов гран. В этом случае полирибосомы находятся внутри особых палочковидных структур, во множестве присутствующих в обладающих фотосинтетической функцией мембранах цианобактерий [17, 18].
Вышеупомянутые сведения об организации аппарата трансляции, связанного с фотосинтетическими мембранами, были получены с помощью биохимических и электронно-микроскопических исследований мембран, выделенных из хлоропластов и цианобактерий в процессе постепенного их освобождения от липидов и белков с помощью обработок детергентами и протеолитическими ферментами с последующим разделением обработанных мембран центрифугированием в ступенчатом градиенте сахарозы. В результате из мембран удалось выделить субструктуры, в обоих случаях содержащие кольцевые полирибосомы.
Цель настоящего исследования состояла в выяснении с помощью того же экспериментального подхода локализации и организации аппарата трансляции в другом виде энергопреобразующих мембран - в мембранах митохондрий одноклеточного эвгленового жгутиконосца Astasia longa. Полученные результаты подтверждают представление о нахождении полирибосом внутри мембран митохондрий. Кроме того, в этих мембранах удалось обнаружить имеющие кольцевую форму субструктуры, выделить их из мембран и из них получить кольцевые полирибосомы. Полученные результаты ведут к представлению о возможности существования общего принципа организации аппарата трансляции в энергопреобразующих мембранах, который состоит в том, что в таких мембранах аппарат трансляции является их интегральной частью и находится в специальных субструктурах.
МЕТОДИКА
Культуру Astasia longa дикого типа выращивали на солевой среде. В 1 л культуральной среды содержались по 1 г ^Н4)2НР04 и KH2PO4, 0.8 г цитрата натрия, 0.2 г MgS04 и смесь микроэлементов (1 мкг ZnS04 ■ 7Н20, 2 мкг MnS04 ■ 3Н20, 10 мкг H3B03, 1 мкг Co(N03)2 ■ 6Н20, 1 мкг Na2Mo04 ■ 2Н20, 0.005 мкг CuS04 ■ 5Н20, 7 мкг FeS04 ■ 7Н20 и 8 мкг Na-ЭДТА). После автоклави-рования 30 мин при 1 атм в каждые 250 мл среды добавляли по 1 мл 96%-ного этанола (источник углерода) и по 0.3 мл стерильных 5%-ных витаминов Bx и B12. Культивирование вели при 25°C до поздней логарифмической фазы (3-4 сут) в условиях пассивной аэрации.
Выделение мембран митохондрий. Клетки A. longa осаждали из объема 500 мл центрифугированием при 500 g, осадок отмывали средой для выращивания культуры, и затем средой для выделения митохондрий (10 мМ Трис-НС1, рН 7.6, 250 мМ сахарозы и 0.1 мМ ЭДТА). Осадок растирали тефлоновым пестиком в течение 5 мин, гомогенизировали в 10 мл той же среды и центрифугировали дважды по 5 мин при 700 g для удаления неразрушенных клеток, ядер и фрагментов клеточной стенки. Внутренние мембраны митохондрий осаждали при 10000 g 40 мин и суспендировали в 1 мл той же среды. Суспензию мембран митохондрий разделяли на пробы, и после соответствующих обработок, как указано ниже, наслаивали на ступенчатый градиент сахарозы (3 мл 80%, 7 мл 60%, по 5 мл 40, 30, 15 и 10%), приготовленный на буфере (10 мМ Трис-НС1, рН 7.6, 0.1 мМ ЭДТА). Центрифугировали 1 ч при 24000 g. Собирали фракции по 1 мл и измеряли оптическую плотность при 260 нм. Все операции проводили при 0°C.
Обработка мембран митохондрий. Мембраны митохондрий обрабатывали протеолитическими ферментами: протеиназой К (100 мкг/мл) и трипсином (200 мкг/мл) 30 мин; Тритоном X-100 (1%) 20 мин; РНКазой (200 мкг/мл) 30 мин. Все обработки проводили при 0°С. С фенолом встряхивали 10 с (рН 8.0) при комнатной температуре с последующим центрифугированием и отделением водной фазы.
Определение плавучей плотности структур фракций из градиента сахарозы. Плавучую плотность фракций из градиента определяли методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия [19]. Использовали преформированный градиент, состоящий их двух ступеней (1.7 и 1.0 г/см3). После центрифугирования в течение 5 ч при 50000 g собирали фракции по 1 мл и во фракциях определяли показатель преломления и оптическую плотность при 260 нм.
Включение 14С-аминокислот в полипептиды.
Мембранные фракции (2-3 мг белка) инкубиро-
Концентрация сахарозы, %
0.4
О
\о
(N
0.2
500
н и
> 400
И
£
н. 300
е и
ен200
5 100 га
0 5 10 15 20 25 Номера фракций
Рис. 1. Распределение мембран, изолированных из митохондрий A. longa при центрифугировании в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы. а - поглощение при 260 нм; б - включение 14С-амино-кислот в полипептиды. 1 - необработанный препарат; 2 - обработка протеиназой К, 3 - обработка фенолом.
вали в среде, содержащей Трис-HCl (pH 7.4) -50 мМ, KCl - 80 мМ, MgSO4 - 10 мМ, KH2PO4 -15 мМ, ЭДТА - 1 мМ, АТФ - 3 мМ, ГТФ - 0.6 мМ, бычий сывороточный альбумин - 1 мг/мл, сахарозу - 3.5 мМ и 14С-гидролизат белка хлореллы -0.2 мКи, в течение 30 мин при 28°С. Радиоактивность измеряли в жидкостном сцинтилляционном счетчике Cl-400 ("Intertechnique", Франция). Учитывали включение 14С-аминокислот в полипептиды, нечувствительное к циклогексимиду.
Электронно-микроскопическое изучение фракций из градиента концентрации сахарозы. Фракции разбавляли в 5-10 раз охлажденной до 0°С средой для выделения митохондрий б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.