НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 213-222
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 591.88:597.5
ЛОКАЛИЗАЦИЯ NADPH-ДИАФОРАЗЫ И НЕЙРОНАЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ В ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОМ ТРАКТЕ У СИМЫ Oncorhynchus masou (OSTEICHTHYES: SALMONIDAE)
© 2012 г. Е. А. Пименова*, А. А. Вараксин
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток
С помощью гистохимического и иммуногистохимического методов исследована морфология, локализация и распределение нитроксидергических нервных клеток и волокон в пищеварительном тракте у молоди и взрослых особей симы Oncorhynchus masou. Выявлены общие и возрастные особенности в распределении и количестве энтеральных NO-ергических нейронов. Установлено, что у молоди они содержатся в пищеводе и желудке, у взрослых рыб — по всей длине пищеварительного тракта, доминируя в передних его отделах. И у молоди, и у взрослых рыб нейроны и нервные волокна расположены преимущественно в составе ветвей блуждающего нерва, межмышечном нервном сплетении и кольцевом слое мышечной оболочки, реже — в подслизистом нервном сплетении и продольном слое мускулатуры. Обнаружены уни- и биполярные нейроны, множество мало- и недифференцированных клеток, количество последних у молоди выше, чем у взрослых особей. Среди многоотростчатых клеток встречались нейроны I и II типов Догеля, наибольшее их количество найдено у взрослых рыб. Кроме того, в мышечной стенке многочисленных кровеносных сосудов и протока плавательного пузыря у молоди и взрослых рыб присутствовали NO-ергические нервные волокна.
Ключевые слова: NADPH-диафораза, нейрональная NO-синтаза, пищеварительный тракт, энтераль-ная нервная система, сима Oncorhynchus masou (Teleostei).
ВВЕДЕНИЕ
В организме оксид азота (NO) синтезируется клетками из аминокислоты L-аргинин. Этот процесс представляет собой комплексную окислительную реакцию, катализируемую ферментом NO-синтазой (NOS), которая присоединяет молекулярный кислород к конечному атому азота в гуа-нидиновой группе L-аргинина [1]. У млекопитающих различают несколько изоформ NOS: нейро-нальную (nNOS), индуцибельную (iNOS) и эндотелиальную (eNOS). Молекулярное клонирование и биоинформационный анализ генома рыб показали, что у них только две изоформы NOS высоко гомологичны NOS млекопитающих — nNOS и iNOS, при этом nNOS доминирует во многих тканях рыб, включая периферическую нервную систему [2, 3]. Установлено, что NOS солокализо-вана с NADPH-диафоразой (NADPH-д), активность которой сохраняется после фиксации в 4% параформальдегиде [4, 5]. В этой связи гистохимическая активность NADPH-д является топографическим маркером структур, содержащих NOS в тканях позвоночных животных [6, 7].
Наличие и распределение ферментов синтеза NO и его физиологическое значение в процессах
*Адресат для корреспонденции: 690041 Владивосток, ул. Пальчевского, 17; тел.: (4232) 31-11-86; e-mail: eapimenova@yandex.ru.
питания и пищеварения у позвоночных животных и человека интенсивно исследуется [8, 9]. Показано участие NO в регуляции перистальтики желудочно-кишечного тракта, контроле кровяного тока, экзокринной и эндокринной секреции. NO относят к числу наиболее важных факторов защиты слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Подробно описано наличие и распределение NADPH-д-позитивных нейронов в пищеварительном тракте некоторых видов половозрелых рыб: акулы Squalus acanthias, трески Gadus morhua [10], тиляпии Tilapia mariae [11], корюшки Hypome-sus japonicus, анчоуса Engraulis japonicus, керчака Myoxocephalus brandti и камбалы Pleuronectes obscu-rus [12—14]. nNOS солокализованная с NADPH-д найдена в периферической нервной системе карася Carassiusauratus [15], форели Salmogairdneri [16] и угря Anguilla anguilla [17]. Существуют работы, посвященные наличию и распределению этих ферментов на ранних стадиях онтогенеза рыб. Гистохимическим, иммуногистохимическим и биохимическим методами обнаружены nNOS и iNOS в кишке 24-дневных личинок окуня Dicentrarchus labrax [18], в энтеральной нервной системе эмбрионов, личинок и взрослых особей полосатого да-нио Danio rerio [19—21].
Цель настоящего исследования — изучение NO-продуцирующей системы в пищеварительном тракте у симы Oncorhynchus masou (Salmonidae).
Для определения источников синтеза NO в пищеварительном тракте, мишеней его действия и возможной физиологической роли этого газа в пищеварении были исследованы наличие, морфология, локализация и распределение NADPH-д-положи-тельных и nNOS-иммуноположительных элементов по всей длине пищеварительного тракта и у рыб разных возрастных групп.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнено на тихоокеанском лососе Oncorhynchus masou (Osteichthyes: Salmo-nidae). Молодь симы в возрасте 1 года и 4 мес. (длина тела АС 6.5—10.0 см) и половозрелые особи в возрасте 3 лет и 4 мес. (длина тела АС 18.0—28.5 см) были приобретены на Рязановском экспериментально-производственном рыбоводном заводе (Приморский край) в мае 2009 г. После транспортировки рыб содержали в аквариуме с аэрируемой пресной водой в течение 2—3 сут для адаптации без питания. Затем их анестезировали в кювете с 1%-ным раствором трикаин метансульфоната (MS-222) на пресной воде в течение 10—15 мин. Пищеварительный тракт исследовали у 5 особей каждой возрастной группы.
Морфологию NO-ергических элементов, их локализацию и распределение в отделах пищеварительного тракта изучали с помощью гистохимического, маркирование NADPH-д [22] и иммуноги-стохимического, маркирование nNOS методов.
Отпрепарированные пищевод, кардиальный и пилорический отделы желудка, передний, средний и задний отделы кишечника фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида, приготовленным на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4), при температуре 4°С в течение 2—4 ч. Материал промывали в 15%-ном растворе сахарозы на 0.15 М трис-HCl буфере (рН 8.0) с интервалом в 6—8 ч в течение суток. Далее готовили криостатные срезы толщиной 20 мкм. Участки пищеварительного тракта резали серийно в поперечном и продольном направлениях.
Для гистохимического исследования срезы инкубировали 1 ч при 37°С в среде, содержащей 0.5 мМ NADPH (Sigma, США), 0.5 мМ нитросине-го тетразолиевого (Sigma, США) и 0.3% тритона X-100 в 0.15 М трис-НС1 буфере (рН 8.0). Препараты быстро споласкивали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в даммаровую смолу. Часть препаратов докрашивали гематоксилином Эрлиха. Контрольные срезы инкубировали: а) без p-NADPH, б) без нитросинего тетразолиевого.
Для иммуногистохимического исследования срезы инкубировали: 1) в 0.3% перекиси водорода в течение 30 мин для блокирования эндогенной пероксидазной активности, 2) в 5% нормальной
сыворотке козы (MP Biomedicals Inc., Франция) в течение 2 ч, 3) с кроличьими поликлональными антителами против nNOS (StressGen Biotechnologies Corp., Канада) в разведении 1 : 1000 в течение 48 ч при температуре 4°C, 4) с биотинилированны-ми антителами (Immuno Universal Kit, MP Biomedicals Inc., Германия) 1 ч при комнатной температуре, 5) с стрептавидин-пероксидазным комплексом (Immuno Universal Kit, MP Biomedicals Inc., Германия) 40 мин при комнатной температуре. Для визуализации продуктов реакции срезы инкубировали с субстратом (Vector SG Substrate Kit, Vector Labs, США), контролируя развитие серо-голубой окраски под микроскопом. Далее срезы промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в даммаровую смолу. Контрольные срезы инкубировали: а) без специфической антисыворотки, б) заменив специфическую антисыворотку нормальной кроличьей. Ни один из проведенных контролей не дал положительной реакции на гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание.
Готовые препараты изучали под световым микроскопом Leica DM4500 B и фотографировали с помощью цифровой камеры Leica DFC300 FX. В каждом исследованном отделе пищеварительного тракта NO-ергические клетки подсчитывали на десяти серийных поперечных срезах. Результаты представлены как среднее число окрашенных клеток на десять срезов. Измерения мышечной оболочки, малого и большого диаметров клеточных тел проводили с использованием программного обеспечения Leica Application Suite. Все цифровые данные представлены как среднее арифметическое ± ошибка среднего арифметического.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Пищеварительный тракт симы O. masou представляет собой трубку, состоящую из пищевода, сифонообразного желудка и кишечника. Сима относится к открытопузырным рыбам, у которых в нижнюю треть пищевода впадает проток плавательного пузыря.
Стенка пищеварительного тракта состоит из серозной, мышечной и слизистой оболочек. Мышечная оболочка в пищеводе образована поперечно-полосатыми мышечными волокнами, ориентированными преимущественно циркуляр-но, в желудке и кишечнике — гладкими кольцевыми (циркулярными) и продольными мышечными волокнами. Толщина мышечной оболочки уменьшается в каудальном направлении. Так, у молоди ее толщина в пищеводе в среднем составляет 359 ± 13 мкм, в заднем отделе кишечника — 39 ± 2 мкм, у взрослых особей — 710 ± 14 и 147 ± ± 9 мкм соответственно.
Таблица 1. Общее количество нитроксидергических клеток на 10 срезов (1) и их доля (%) в подслизистом сплетении (2), кольцевом слое мышечной оболочки (3) и межмышечном сплетении (4) пищеварительного тракта симы Опевгкупекия таяви
Отдел Молодь Взрослые особи
1 2 3 4 1 2 3 4
Пищевод 45 ± 27 2 9 89 48 ± 21 2 6 92
Кардиальный отдел желудка 38 ± 1 0 3 97 49 ± 2 11 5 84
Пилорический отдел желудка 43 ± 19 12 55 33 56 ± 22 5 42 53
Передний отдел кишечника 0 0 0 0 9 ± 0 0 25 75
Средний отдел кишечника 0 0 0 0 17 ± 0 0 12 88
Задний отдел кишечника 0 0 0 0 21 ± 8 0 19 81
Таблица 2. Соотношение мало- и недифференцированных (1), уни- (2), би- (3) и мультиполярных (4) МАЭРН-д-позитивных нейронов в пищеварительном тракте симы Опевгкупекия таяви, %
Отдел Молодь Взрослые особи
1 2 3 4 1 2 3 4
Пищевод 41.7 20.8 20.8 16.7 36.0 24.0 24.0 16.0
Кардиальный отдел желудка 61.2 19.4 9.0 10.4 50.0 28.1 6.3 15.6
Пилорический отдел желудка 67.7 11.8 17.6 2.9 11.3 8.1 8.1 72.5
Передний отдел киш
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.