НЕИРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 1-2, с. 105-110
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 591.112.1
МЭ-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРЫ - НОВЫЙ ПОСРЕДНИК ДЕЙСТВИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА НА МИОКАРД
© 2008 г. Д. В. Абрамочкин*, М. А. Сурис, А. А. Бородинова, В. С. Кузьмин, Г. С. Сухова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
В условиях внутриклеточной регистрации потенциалов действия сердца крысы показано, что неселективный агонист мускариновых холинорецепторов пилокарпин в предсердиях активирует как М2, так и М3-холинорецепторы. Активация М3-рецепторов выявлена на фоне блокады М2-рецеп-торов метоктрамином (100 нМ). При этом наблюдалось изменение длительности ПД и конфигурации фаз реполяризации. Эффект устранялся селективным блокатором М3-рецепторов 4-БЛМР (10 нМ), а также при ингибировании фосфолипазы С соединением и-73122 (1 цМ). Это дает основания предполагать, что эффекты активации М3-рецепторов в предсердном миокарде хотя бы частично связаны с фосфоинозитольным каскадом.
Ключевые слова: ацетилхолин, мускариновыерецепторы, потенциал действия, пилокарпин.
Принятые сокращения: АЦХ - ацетилхолин, М-рецепторы - мускариновые рецепторы, ПД - потенциал действия.
ВВЕДЕНИЕ
Среди всех видов регуляторных воздействий на сердце парасимпатическая регуляция является, пожалуй, наиболее важным. Механизмы парасимпатических влияний интенсивно изучаются с тех пор, как в 1845 г. братья Вебер впервые описали вагусное замедление сердца. Во второй половине прошлого века был во многом раскрыт механизм действия АЦХ, основного медиатора парасимпатических постганглионаров, на миокард. Оказалось, что эффекты АЦХ опосредуются в основном М2-холинорецепторами, сопряженными с в;-белками. Однако этот механизм не объясняет все разнообразие кардиотропных эффектов АЦХ, например его кардиопротекторное воздействие на миокард [1].
В последние 5-7 лет появляются данные о других типах мускариновых рецепторов в опосредовании кардиотропных эффектов АЦХ. Обобщая данные электрофизиологических [2-5], биохимических [6, 7], молекулярно-биологических [8-10] и иммуногистохимических [11] исследований, можно заключить, что кроме М2-рецепторов, преобладающих в миокарде, важную роль в регуляции работы сердца играют М3-холинорецепто-ры [12]. С одной стороны, их наличие на мембранах кардиомиоцитов показано с использованием флуоресцентных антител [11], с другой стороны -методом ЯТ-РСЯ была обнаружена мРНК М3-ре-
* Адресат для корреспонденции: 119991, Москва, Воробьевы горы, д. 1, корп. 12, тел. (495) 939-14-16, e-mail: abram340@mail.ru
цепторов [8-11]. Наконец, электрофизиологические исследования с использованием селективных блокаторов различных типов М-рецепторов позволили описать новый калиевый ток 1КМ3, возникающий при активации именно М3-рецепторов [5]. Отметим, что М1 и М4-холинорецепторы, по-видимому, не принимают участие в опосредовании действия АЦХ на кардиомиоциты. М1-рецеп-торы не экспрессируются в кардиомиоцитах, они присутствуют лишь в окончаниях аксонов пост-ганглионарных нейронов, находящихся в миокарде, М4-рецепторы обнаруживаются в кардиомиоцитах, но в очень малых количествах.
Результаты недавних исследований указывают также на возможную роль М3-рецепторов в кардиопротекторном действии АЦХ при ишемии. В модели инфаркта миокарда у крыс избирательная активация М3-рецепторов снижала размер очага некроза [13], а в опытах на культуре кардиомиоцитов давала антиапоптотический эффект [13]. Интересно, что ишемия вызывает быстрое (в течении нескольких минут) увеличение плотности М3-рецепторов на сарколеммах кардиомиоцитов, чего нельзя сказать в отношении М2-рецепторов. Скорее всего это связано с увеличением скорости транспорта М3-рецепторов на поверхность клетки или замедлением их интернализации [14]. При этом известно, что ишемия нарушает связь М3-рецепторов с коннек-сином Сх43, основным белком щелевых контактов миокарда [14]. Предполагается, что увеличение количества М3-рецепторов является защит-
ной реакцией, призванной смягчить последствия ишемии.
Итак, значимость М3-рецепторов как мишени для воздействия АЦХ на кардиомиоциты в настоящее время не вызывает сомнений. Тем не менее до сих пор не показано, каковы изменения конфигурации ПД миокарда, связанные с активацией М3-рецепторов. С другой стороны, не ясно, какие пути внутриклеточной сигнализации задействованы при активации М3-рецепторов и вызывают те или иные изменения параметров электрической активности миокарда.
В данной работе мы демонстрируем влияние на конфигурацию ПД в предсердии крысы избирательной активации М3-рецепторов, полученной с помощью агониста М-рецепторов пилокарпина, в некоторой степени селективного в отношении М3-рецепторов, и сравнительно высоко селективных антагонистов различных типов М-рецепторов [1,15,16]: М2 (метоктрамина), М1 (пирензепина) и М3 (4-DAMP).
Известно, что М3-рецепторы сопряжены с Gq-белками, при активации рецепторов ßy-субъ-единица Gq-белка, по всей видимости, открывает каналы тока IKM3 [5, 12]. а^субъединица активирует фосфолипазу С, образующийся инозитол-трифосфат связывается со своими рецепторами на мембране саркоплазматического ретикулума и вызывает выброс ионов кальция, а диацилглице-рол совместно с кальцием активирует протеинки-назу С, которая с помощью фосфорилирования влияет на работу ионных каналов. В данной работе мы показываем, в какой степени фосфоинози-тольный каскад отвечает за электрофизиологические эффекты активации М3-рецепторов. Для этого мы применили высокоспецифичный блока-тор фосфолипазы С U-73122 [17, 18], а также бло-катор рецепторов инозитолтрифосфата 2-АРВ.
МЕТОДИКА
В работе было использовано 35 самцов белых беспородных крыс. Животных декапитировали, немедленно вскрывали грудную клетку и выделяли сердце, которое промывали раствором Тироде (состав в ммоль/л: NaCl 133.47, KCl 4.69, NaH2PO4 ■ ■ 2H2O 1.35, NaHCO3 16.31, MgSO4 ■ 7H2O 1.18, CaCl2 ■ 2H2O 2.5, глюкоза 7.77), насыщенным кар-богеном (газовая смесь 95% 02, 5% С02). Ушко правого предсердия отрезали и помещали в камеру объемом 3 мл, где препарат суперфузировался раствором Тироде при температуре 38°С со скоростью 10 мл/мин. Препарат закрепляли на дне камеры эндокардиальной стороной вверх, на протяжение всего эксперимента препарат работал с навязанной частотой 6 Гц за счет стимуляции двумя серебряными электродами, помещенными на край препарата.
Для регистрации ПД применили стандартный метод внутриклеточного отведения биоэлектрической активности с помощью стеклянных микроэлектродов сопротивлением 15-30 МОм. Сигнал оцифровывался на аналогово-цифровом преобразователе Е14-140 (Ь-Сагё, Россия) и записывался на компьютере с помощью программы Ь-вгарИ у.1.0 (Ь-Сагё, Россия). После получения стабильного отведения электрической активности подавали в камеру раствор, содержащий исследуемое вещество и начинали запись, отведение поддерживали на протяжении всего времени действия вещества (6 мин). При изучении действия пилокарпина на фоне того или иного блокатора сперва в течение 10 мин подавали раствор блокатора, а сразу после этого - раствор, содержащий блока-тор в той же концентрации вместе с пилокарпином.
Обработку данных проводили в программе МШАщ^в у.3.0.1 (БутрК^ой, США). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы 8Ш1виса у.6.0. Для оценки достоверности различий для связанных выборок использовали критерий Вилкоксона, для несвязанных - критерий Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На начальном этапе исследования определяли изменения конфигурации ПД предсердия крысы под действием пилокарпина. На основании данных предыдущих работ и нескольких пробных экспериментов мы выбрали концентрацию пилокарпина 10 мкМ как оптимально подходящую для активации холинорецепторов в предсердии крысы. Пилокарпин в концентрации 1 мкМ вызывал слабое укорочение ПД, но в концентрации 10 мкМ давал заметное уменьшение длительности ПД (на 47.9+/-8.6% на уровне 90% реполяризации ПД и на 56.4+/-7.6% на уровне 50% реполяризации ПД; п = 5; см. рис. 1А). Не было обнаружено заметных изменений мембранного потенциала и амплитуды ПД. Эффект развивался постепенно, достигая максимума на 4-й мин действия вещества, во всех дальнейших опытах с пилокарпином наблюдалась такая временная зависимость, поэтому далее мы будем указывать только максимальные значения.
Однако столь выраженный эффект обусловлен активацией не только М3, но и М2-холиноре-цепторов, так как селективность пилокарпина мала. Поэтому для получения избирательной активации М3-рецепторов мы использовали пилокарпин (10 мкМ) в присутствии селективного антагониста М2-рецепторов метоктрамина. Известно, что метоктрамин проявляет селективность в концентрациях не больших, чем 0.5 мкМ [16], поэтому мы применяли его в концентрации 100 нМ. На фоне метоктрамина эффект пилокарпина
40
20
0
-20
-40
-60
-80 40
20
0
-20
-40
-60
-80
150
Контроль(Ме1 10-7, 4-БЛМР 10-8)
150
40
20
0
-20
-40
-60
-80 40
20
0
-20
-40
-60
-80
Контроль (Ме1 10-7)
150
Контроль(Ме1 10-7, и-73122 104)
РИ 10-5, Ме1 10-7, и-73122 104
100
150
Рис. 1. Оригинальные записи ПД: действие пилокарпина на ПД предсердий крысы. По оси ординат - мембранный потенциал, мВ; по оси абсцисс - время, мс. Черным цветом показан контрольный ПД (непосредственно перед воздействием пилокарпина), серым - ПД во время максимального эффекта пилокарпина. А - укорочение ПД под действием 10 мкМ пилокарпина, Б - под действием 10 мкМ пилокарпина в присутствии 100 нМ метоктрамина, В - в присутствии 100 нМ метоктрамина и 10 нМ 4-БАМР, Г - в присутствии 100 нМ метоктрамина и 1 мкМ и-73122.
был значительно слабее выражен: укорочение ПД составило 14.4+/-2.2% на уровне 50% реполяризации и 13+/-1.2% на уровне 90% реполяризации; п = 8, р < 0.05 (см. рис. 1Б, 2). Однако меток-трамин в концентрации 100 нМ мог заблокировать не все М2-рецепторы, тогда наблюдаемый эффект пилокарпина может быть связан с активацией не М3-рецепторов, а тех М2-рецепторов, которые остались незаблокированными. Чтобы проверить эту возможность, мы провели несколько экспериментов с метоктрамином в концентрации 500 нМ, но и в этом случае пилокарпин де
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.