^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1
МАРКЕРЫ, СВЯЗАННЫЕ С ЛОКУСОМ ПОЛА У ДВУДОМНЫХ РАСТЕНИЙ СПАРЖИ Asparagus officinalis
© 2007 г. В. Ц. Гао*' **, Р. Л. Ли**, Ш. Ф. Ли**, Ч. Л. Дэн**, С. П. Ли*
* Кафедра биологии, Хенанъский университет, Хенанъ, Кайфэн, Китай ** Кафедра биологии, Хенанъский педагогический университет, Хенанъ, Синъсян, Китай
Поступила в редакцию 03.08.2006 г.
С целью выявления молекулярных маркеров, связанных с полом, у двудомных растений Asparagus оfficinalis исследовали сто праймеров длиной 10 п.н. произвольно амплифицирующейся полиморфной ДНК (Random Amplified Polymorphic DNA). Один из праймеров (S368) указывал на наличие двух маркеров (S3689-28 и S3681-178) при реакции с ДНК женских растений. Наличие этих двух маркеров проверили у 30 мужских и 30 женских растений, и маркер S368-9-28 оказался специфичным только для женского полового локуса. Маркер S368-9-28 секвенировали и на его основе синтезировали специфичные праймеры для получения SCAR-маркера с последовательностью амплифициро-ванных фрагментов длиной 928 п.н. для растений женского пола - SCAR928. SCAR928 можно использовать для достоверного отбора гомозиготных mm растений женского пола A. officinalis. Однако результаты гибридизации по Саузерну показали, что гибридизация с зондом S3689-28 происходила с образцами ДНК растений обоих полов.
Ключевые слова: Asparagus officinalis - двудомностъ - RAPD - SCAR - маркеры ДНК, сцепленные с локусом пола.
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 913-919
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Спаржа (Asparagus officinalis L.) - двудомное растение. Растения спаржи бывают либо мужскими, либо женскими, имеют 2n = 2х = 20 хромосом, а гаплоидный размер генома составляет 1323 млн. п.н. [1]. Генетические исследования показали, что половой диморфизм спаржи обусловлен наличием доминантного гена M, расположенного в хромосоме L5 [2, 3]. Женские растения гомозиготны по рецессивным аллелям (mm), а мужские - либо гомозиготны (MM), либо гетерозиготны (Mm) по пол-определяющему гену [4]. Однодомные мужские растения в популяции спаржи гетерозиготны по гену M и способны давать некоторое количество семян при самоопылении. По сравнению с женскими растениями, образующими семена, мужские растения имеют более длинные и толстые побеги, дают более высокий урожай, более
Сокращения: BSA - общий сегрегационный анализ (от Bulk Segregant Analysis); MAS - маркерная селекция (от Marker Assisted Selection); ПЦР - полимеразная цепная реакция; RAPD - произвольно амплифицирующаяся полиморфная ДНК (от Random Amplified Polymorphic DNA); SCAR - ампли-фицированные фрагменты с охарактеризованной последовательностью (от Sequence Characterized Amplified Regions); SSC -хлоридно-натриевый/ц итратно-натриевый буфер. Адрес для корреспонденции: Dr. W.J. Gao. College of Life Science, Henan Normal University, Henan, Xinxiang, 453007, China. Fax: +86 (0373) 3326341; e-mail: gao.wujun@yahoo.com.cn
устойчивы к болезням и дольше живут. С целью размножения спаржи при опылении женских растений предпочтительно использовать так называемые сверх-мужские растения MM, так как в этом случае получается чисто мужское потомство. Однако растения MM нельзя отличить от растений Mm даже на стадии цветения [5]. В настоящее время для этого требуются длительные эксперименты по перекрестному опылению. Кроме того, чтобы отличить мужские растения от женских, необходимо вырастить растения до стадии цветения, что занимает от 2 до 3 лет. Поэтому крайне необходимо создать кодоминантные молекулярные маркеры, связанные с полом, с помощью которых можно было бы различать мужские, женские и сверх-мужские растения на стадии проростков, и тем самым ускорить процесс селекции. Это облегчило бы также процесс клонирования генов данного вида, обуславливающих половой детерминизм, и помогло бы понять стоящие за ним механизмы на молекулярном уровне.
В настоящее время в качестве генетических маркеров широко используются молекулярные маркеры RAPD - произвольная амплифицирующаяся полиморфная ДНК (от Random Amplified Polymorphic DNA) [6, 7], AFLP - амплифицирую-щиеся полиморфные по длине фрагменты (от Amplified Fragment Length Polymorphisms) [8] и SSR - простые повторяющиеся последовательности (от Simple Sequence Repeats) [9]. Из них RAPD-
маркеры имеют ряд преимуществ, из которых самые важные - это простота их получения и удобство для исследования генетического полиморфизма у тех видов растений, о геномных последовательностях которых нет достаточно подробной информации [10]. Недостаток маркеров RAPD -их изменчивость в зависимости от исходных препаратов ДНК и условий проведения опытов. Однако на основе RAPD-маркеров можно получить более стабильные и надежные маркеры путем клонирования амплифицированных участков и секвенирования их концов, в результате чего можно изготовить длинные олигомерные прай-меры. Амплификация с применением длинных олигомеров при строгом соблюдении условий отжига и гибридизации дает один набор фрагментов, в точности соответствующих исследуемому локусу генома, и такие фрагменты называются SCAR - амплифицированные фрагменты с охарактеризованной последовательностью (от Sequence Characterized Amplified Regions) [11]. Данный метод уже был использован для получения нескольких пол-специфичных молекулярных маркеров ряда двудомных растений, а именно Silene latifolia [12], Pistacia vera [13], Cannabis sativa [14], Humulus lupulus [15], Actinidia chinensis [16], Atriplex garettii [17], Carica papaya [18], Salix viminalis [19], Rumex acetosa [20], Mercurialis annua [21] и Eucommia ulmoides [22].
Для спаржи уже разработан ряд генетических маркеров, в том числе морфологических, изофер-ментных и геномных [2, 3]. Однако, хотя несколько маркеров на базе ДНК были специфичны для пол-определяющих генов спаржи, но с их помощью можно было определить лишь процентное соотношение полов растений и оценить ресурс генофонда. Кроме того, генетическое расстояние между такими маркерами и исследуемым локу-сом слишком велико для их практического использования с целью маркерной селекции (MAS от Marker Assisted Selection) и составления на основании клонирования половых генов генетической карты. Следовательно, имеется срочная потребность в новых маркерах, теснее связанных с локусом пола, для быстрого, простого и раннего определения пола растения при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). В данной работе мы представляем результаты поиска связанного с полом SCAR-маркера для A. officinalis с помощью метода RAPD в сочетании с объемным сегрегационным анализом (BSA) мужских и женских пулов ДНК.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Растения Asparagus officinalis L. выращивали при естественном освещении с естественным фотопериодом на опыт-
ном поле вблизи Хенаньского педагогического университета. После определения пола растений собирали образцы листьев (около 1 г) и замораживали при -80°С.
Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли из каждого образца при помощи незначительно измененного метода [23], основанного на применении цетил-триметилбромида аммония. Около 0.3 г замороженной ткани листьев перемалывали в мелкий порошок в жидком азоте и смешивали с 700 мкл буфера CTAB (100 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 1.4 М NaCl, 20 мМ ЭДТА (pH 8.0), 0.5% NaHSO3, 2% CTAB, 1%-ный p-меркаптоэта-нол, 1%-ный поливинилпирролидон) в пробирке типа Eppendorf объемом 1.5 мл. Смесь нагревали до 65°C в течение 1 ч. Затем добавляли равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24 : 1) и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Водную фазу дважды отбирали и переносили в чистую пробирку с целью уменьшения межфазного загрязнения. Экстракцию проводили дважды: первый раз смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25 : 24 : 1), а второй - смесью хлороформа и изоамилового спирта (24 : 1). В последний раз водную фазу смешивали с 2/3 объема изопропанола и 1/10 объема 2 М раствора ацетата натрия (pH 5.2). Смесь выдерживали при -20°C не менее 1 ч для осаждения ДНК, и затем центрифугировали при 8000 g в течение 15 мин, при температуре 4°C. Осадок нуклеиновых кислот промывали 70%-ным раствором этанола, сушили на воздухе и суспендировали в 200 мкл бидистиллята, содержавших РНКазу А в количестве 10 мг/мл. Смесь выдерживали при 37°C в течение 1 ч. Выделенную ДНК растворяли в бидистилляте до окончательной концентрации 40 н г/м кл для последующей амплификации в по-лимеразных цепных реакциях. Путем объединения одинаковых количеств ДНК, выделенных из 10 произвольно выбранных растений, получили два больших пула ДНК: один - для мужских растений, другой - для женских.
RAPD-анализ потенциальных маркеров. Для RAPD-анализа опробовали сто праймеров длиной 10 п.н. с произвольной последовательностью ("Operon Technologies", США). С каждым прайме-ром проводили ПЦР для ДНК каждого из двух пулов. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 40 нг геномной ДНК, 10 мМ Трис-HCl (pH 9.0 при 25°C), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ дез-оксинуклеозидтрифосфатов, 0.5 мкмоль прайме-ра и 1.5 единицы Taq-ДНК полимеразы. Амплификацию проводили на приборе Gene Amp PCR System 2400 ("Perkin-Elmer Corporation", США). Реакция состояла из 45 циклов, каждый из которых включал 1 мин при 94°C, 1 мин при 36°C и 2 мин при 72°C, после чего следовал один цикл длительностью 5 мин при 72°C и выдержка при 4°C перед
Праймеры для амплификации SCAR-маркера, связанного с локусом пола A. officinalis
RAPD-праймер SCAR-праймеры Последовательность 5'-3' Температура отжига
S368 SCAR928L SCAR928R GAACACTGGG GGGATTAAAA CAAA GAACACTGGG GCATAATACT AGTA 60°C
последующим анализом. Продукты амплификации анализировали с помощью 1.5%-ного агароз-ного гель-электрофореза ("Promega", США) в буфере 1 х TAE (0.04 М Трис-уксусная кислота, 0.01 М ЭДТА). Гель окрашивали бромистым эти-дием и рассматривали в ультрафиолетовом свете. Каждую реакцию амплификации проводили с одним праймером и повторяли три раза для подтверждения воспроизводимости результатов.
ДНК-маркер, присутствовавший только в одном из пулов - мужском или женском, и отсутствовавший в другом пуле, рассматривали как потенциальный маркер, св
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.