СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2004, том 18, № 4, с. 305-316
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 612.843.116.1
МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ФОТОТРАНСДУКЦИИ И СВЕТОВОЙ АДАПТАЦИИ В ПАЛОЧКАХ СЕТЧАТКИ ЛЯГУШКИ
© 2004 г. Д. Г. Кузьмин, С. В. Травников, М. Л. Фирсов, В. И. Говардовский
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44 Поступила в редакцию 29.12.03 г.
В работе представлена детальная математическая модель процессов возбуждения и световой адаптации в палочках, включающая все достоверно установленные сейчас механизмы регуляции каскада фототрансдукции. Модель исследуется применительно к ответам на свет одиночной палочки лягушки Rana ridibunda, зарегистрированным при помощи всасывающего микроэлектрода. Показано, что при подборе параметров модели в диапазоне значений, известных из независимых биохимических и физиологических экспериментов, можно количественно описать ответы палочки в широком диапазоне условий стимуляции. Для хорошего воспроизведения ответов на вспышки и ступеньки света, поданные в темноте, модель должна включать двухкомпонентный кальциевый буфер, состоящий из быстро- и медленнообмениваемой фракций. Для описания ответов на вспышки умеренной яркости, поданные на световом фоне, необходимо ввести гипотетическое кальцийзависимое ускорение выключения светоактивированной фосфодиэстеразы, не продемонстрированное пока биохимически. Ответы на выключение фона и на яркие вспышки в состоянии световой адаптации не воспроизводятся. Недостатки модели более поучительны, чем ее достоинства, так как указывают на существование неизвестных пока механизмов регуляции каскада фототрансдукции.
Ключевые слова: палочки, фототрансдукция, световая адаптация, математическое моделирование.
ВВЕДЕНИЕ
Сигнал от поглотившей квант света молекулы зрительного пигмента в фоторецепторах позвоночных передается посредством двухступенчатого ферментативного каскада, который изменяет концентрацию внутриклеточного посредника -3', 5'-цГМФ. цГМФ управляет проводимостью ионных каналов плазматической мембраны, вызывая электрический ответ клетки. Работа каскада контролируется несколькими цепями отрицательной обратной связи, регулирующими временной ход и чувствительность фотоответа и тем обеспечивающими приспособление фоторецептора к работе при разных уровнях освещенности. Подробно схема каскада фототрансдукции рассмотрена в ряде современных обзоров (Фирсов, Говардовский, 2001; Каламкаров, Островский, 2002; Pugh, Lamb, 2000), поэтому здесь мы только кратко опишем основные принципы его работы (схема рис. 1).
Концентрация цГМФ в цитоплазме наружного сегмента (НС) фоторецептора определяется балансом между его синтезом из ГТФ гуанилатцик-лазой (ГЦ) и гидролизом фосфодиэстеразой (ФДЭ). Поглощение кванта света молекулой родопсина переводит ее в активную конформацию, которая катализирует обмен ГДФ на ГТФ на не-
скольких сотнях молекул ГТФ-связывающего белка - трансдуцина (Т). Каждая "заряженная" ГТФ а-субъединица трансдуцина активирует одну каталитическую субъединицу ФДЭ. Ускоренный гидролиз цГМФ приводит к падению его концентрации и закрыванию каналов плазматической мембраны, генерируя таким образом электрический ответ на свет. Ответ прекращается за счет того, что светоактивированный родопсин теряет каталитическую активность в результате фосфори-лирования его родопсинкиназой и связывания аррестина, комплекс трансдуцин/ФДЭ инактиви-руется вследствие присущей ему ГТФазной активности, а концентрация цГМФ восстанавливается в результате работы гуанилатциклазы.
Три достоверно установленные цепи обратной связи работают за счет изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ при освещении. В темноте кальций входит внутрь наружного сегмента фоторецептора через открытые каналы плазматической мембраны и непрерывно откачивается из цитоплазмы Ка+/Са2+, К+-обменником, расположенным в той же мембране. Обмен не является электронейтральным и создает так называемый обменный ток, поскольку перенос через мембрану одного иона Са2+ сопряжен с переносом
Рис. 1. Схема биохимического каскада фототрансдукции в фоторецепторах позвоночных (Фирсов, Говардовский, 2001). Толстые сплошные стрелки показывают прямой путь передачи сигнала от поглотившей квант света молекулы зрительного пигмента (Л*) к ионным каналам плазматической мембраны. Реакции, приводящие к инактивации каскада, показаны пунктиром. Штриховые стрелки обозначают пути кальциевой обратной связи, обеспечивающей световую адаптацию. Остальные объяснения в тексте.
одного иона K+ и обратным переносом четырех ионов Na+.
Закрывание каналов на свету уменьшает входящий поток ионов, и концентрация Ca2+ в цитоплазме понижается за счет работы обменника. Понижение цитоплазматической концентрации кальция активирует, через кальцийсвязывающий белок рековерин, родопсинкиназу и тем ускоряет выключение активированного родопсина. Другим результатом понижения концентрации кальция является ускорение синтеза цГМФ гуанилат-циклазой через специфический белок GCAP (gua-nylate cyclase-activating protein). Третьей мишенью кальциевой обратной связи служат цГМФ-управ-ляемые каналы плазматической мембраны. При понижении концентрации кальция их сродство к цГМФ увеличивается, так что каналы открываются при более низкой концентрации посредника. Все три эффекта кальциевой обратной связи приводят к выходу фоторецептора из насыщения при ярком освещении и служат механизмом световой адаптации (Фирсов, Говардовский, 2001; Nikonov et al., 2000; Govardovskii et al., 2000).
Современные знания как о физиологических, так и биохимических механизмах работы палочки достаточно детальны для того, чтобы можно было ожидать построить математическую модель, способную количественно описать процессы фототрансдукции и адаптации. Модели разной
степени сложности создавались достаточно давно, однако в большинстве случаев предназначались для качественного описания некоторых особенностей фотоответа с целью выяснения роли отдельных компонентов фототрансдукционного каскада (Tranchina, Peskin, 1988; Forti et al., 1989; Sneyd, Tranchina, 1989; Lamb, Pugh, 1992; Каймач-ников и др., 1992; Каймачников и др., 1993; Kouta-los et al., 1995а; Koutalos et al., 1995b; Hamer, Tyler, 1995; Kamiyama et al., 1996; Nikonov et al., 1998; Hamer, 2000). Лишь в одной из недавних работ представлена достаточно детализированная модель, дающая количественные предсказания и позволяющая прямое сравнение с экспериментом (Nikonov et al., 2000). Эта модель удовлетворительно предсказывает ответы палочки амбистомы на короткие вспышки света в состоянии темно-вой адаптации и стационарные уровни фототока, достигаемые при постоянном освещении. Модель, однако, не описывает ни кинетику достижения этих стационарных уровней, ни ответы на вспышки, поданные на стационарном световом фоне.
В данной работе мы представляем наиболее полную математическую модель фототрансдук-ции и адаптации, которая включает все надежно установленные в настоящее время биохимические механизмы. Результаты моделирования сравниваются с серией экспериментальных записей ответов одиночной палочки сетчатки лягушки.
Модель дает хорошее количественное описание фотоответов в широком диапазоне условий стимуляции, но все же не воспроизводит их полностью. Недостатки модели более поучительны, чем ее достоинства, так как указывают на существование до сих пор неизвестных механизмов регуляции фототрансдукционного каскада.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Фототок одиночных палочек лягушки Rana ridibunda регистрировался при помощи всасывающего микроэлектрода (Baylor et al., 1979). Сетчатка извлекалась у темноадаптированных животных, разрывалась в капле раствора Рингера (состав в мМ: NaCl, 100; KCl, 2.5; CaCl2, 1; MgSO4, 1; глюкоза, 10; HEPES, 10, pH 7.5; бычий сывороточный альбумин, 10 мг/л) при помощи двух пинцетов на возможно более мелкие куски и полученная суспензия клеток помещалась в проточную камеру. При этой процедуре в растворе оказывалось некоторое число относительно ин-тактных палочек, сохранивших значительную часть внутреннего сегмента. Их поиск и измерение размеров наружного сегмента проводились под контролем инфракрасной телевизионной системы. Отведения от таких клеток выполняли, засасывая в пипетку наружный сегмент.
Световая стимуляция и сбор данных проводились при помощи управляющей компьютерной программы LabView (National Instruments, США). Регистрация велась с интервалом дискретизации 10 мс (ответы на вспышки) или 20 мс (ответы на длительные стимулы); перед записью сигнал подвергался аналоговой фильтрации (фильтр низких частот с частотой среза 30 Гц). При необходимости в дальнейшем могла применяться дополнительная цифровая фильтрация. Параллельно выходной сигнал усилителя и отметки световой стимуляции непрерывно записывались с дискретизацией 2 мс на твердый диск отдельного компьютера, создавая таким образом полный протокол эксперимента. Такая запись была полезной, например, для выявления и коррекции медленного дрейфа потенциала электродов.
Для стимуляции вспышками (10 мс) или ступеньками света использовался сверхъяркий све-тодиод с максимумом излучения при 515 нм. Интенсивность стимула регулировалась силой тока через светодиод и введением нейтральных светофильтров. Абсолютная калибровка силы света (в числе изомеризованных молекул родопсина за вспышку, R*) проводилась у каждой индивидуальной клетки по флюктуациям ответа на слабые (2-5 R*) вспышки (Firsov et al., 1994).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для моделирования использовали экспериментальные записи фототока от одной палочки при различных условиях световой стимуляции. Клетку выбирали на основе ее стабильного состояния (величина темнового тока, составлявшая 16.3 пА, не изменялась на протяжении двух часов).
Описание модели. Основные уравнения модели фототрансдукции, описывающие обмен цГМФ, обмен Са2+ и кинетику активации/инактивации родопсина и ФДЭ, в целом повторяют опубликованные ранее модели. Мы большей частью использовали обозначения и форму записи уравнений, аналогичные Никонову и др. (№копоу й а1., 2000), чтобы облегчить сопоставление моделей и не оста
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.