УДК 577.2.
МЕХАНИЗМ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ: ПРОНИКНОВЕНИЕ В КЛЕТКУ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
© 2013 г. В. Х. Хавинсон1'2, А. Ю. Соловьев2, С. И. Тарновская2, Н. С. Линькова2
1Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург 2Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии E-mail: miayy@yandex.ru
Проанализированы данные, отражающие различные аспекты молекулярно-клеточного механизма биологической активности коротких пептидов, используемых в качестве потенциальных лекарственных препаратов. На основе литературных и собственных экспериментальных данных рассматривается возможный механизм проникновения коротких пептидов в цитоплазму и ядро клеток. Обоснована возможность участия коротких пептидов в механизмах эпигенетической регуляции экспрессии генов путем их комплементарного связывания с промотерными зонами генов в ДНК.
Ключевые слова: короткие пептиды, проникновение в клетку, эпигенетическая регуляция, экспрессия генов.
Короткие пептиды, состоящие не более чем из 20 аминокислотных остатков с молекулярной массой до 3,5 кДа, являются сигнальными молекулами, участвующими в регуляции гомеостаза на различных уровнях организации живой материи. И.П. Ашмарин определил эндогенные регулятор-ные пептиды как часть "сложнейшей системы специализированных молекул-сигнализаторов и переносчиков информации между клетками организма" (Ашмарин, 2002).
Создание лекарственных препаратов на основе коротких пептидов - пептидная биотехнология -является актуальным направлением современной молекулярной биологии и фармакологии. Термин "пептидная биотехнология" появился более 50 лет назад, однако активное развитие этого направления наблюдается лишь в последние два десятилетия. Первый синтетический пептид ок-ситоцин был создан американским биохимиком Винсентом дю Виньо в 1953 г., за что в 1955 г, он получил Нобелевскую премию по химии (Би ^^пеаиё et а1., 1953).
В России создание лекарственных препаратов на основе коротких пептидов активно развивается с 70-х годов XX века в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова и Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии (Хавинсон, 2001; КИау^оп et а1., 2005), в Институте биоорганической химии им. М.М. Ше-
мякина и Ю.А. Овчинникова РАН (1уапоу У.Т. et а1., 2005; Deigin VI. et а1., 2007), в Институте молекулярной генетики РАН (Муазоеёоу К.Б. et а1., 2011), в НИИ фармакологии им. В.В. Закусо-ва (08^оУ8кауа Я.и. et а1., 2007).
Результаты многолетних исследований привели к заключению, что активность коротких пептидов является селективной или тканеспецифи-ческой (Хавинсон, 2001; Хавинсон и др., 2012; Аш8тоу V.N. et а1., 2010). Далее была предложена модель развития патологических процессов, согласно которой ключевую роль в них играют нарушения пептидергической регуляции. Коррекция таких нарушений путём дополнительного введения в организм коротких пептидов должна приводить к регрессии патологического процесса и нормализации нарушенных функций организма. Таким образом, были установлены главные преимущества низкомолекулярных пептидов по сравнению с высокомолекулярными белковыми регуляторами: они обладают высокой биологической активностью, проявляют тканеспецифич-ность, у них отсутствуют видоспецифичность и иммуногенность (Хавинсон, 2001). Длительный характер действия, производимого эндогенными пептидами, позволяет предположить, что, по крайней мере, некоторые из них влияют на изменения активности генов, что может быть справедливо и для синтетических пептидных
соединений (Ванюшин, 2004; Khavinson et al., 2005).
Несмотря на высокую эффективность лекарственных препаратов на основе коротких пептидов, механизм их биологической активности долгое время оставался дискуссионным по ряду вопросов: способны ли молекулы пептидов проникать в клетку, каков принцип их трансмембранного переноса и внутриклеточной регуляции гомеостаза? Только в настоящее время, благодаря развитию эпигенетики и пептидной биотехнологии, можно предложить схему взаимодействия пептидов с мембраной клетки и ДНК, позволяющую объяснить их высокую биологическую активность.
ПРОНИКНОВЕНИЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ В ЦИТОПЛАЗМУ И ЯДРО КЛЕТКИ
В конце прошлого столетия было установлено, что короткие пептиды, синтезированные на основе Tat-белка (активатор транскрипции вирусного генома иммунодефицита человека HIV-1), способны проникать внутрь клетки (Frankel et al., 1988). Эти пептиды были созданы в качестве трансмембранных носителей для лекарственных веществ. Так возник термин cell-penetrating peptides (CPP), объединяющий пептиды, транспортирующие в клетку белки, нуклеиновые кислоты и липосомы (Kyte et al., 1982: Lindgren et al., 2000: Morozov et al., 1998).
Многолетние наблюдения показали, что проникновение в клетку через мембрану чаще всего свойственно щелочным пептидам, содержащим в структуре избыток положительно заряженных аминокислотных остатков. Преимущество этих пептидов заключается в том, что они легко преодолевают слой кислого гликокаликса, который прилегает к клеточной мембране (Frankel et al., 1988; Futaki et al., 2003; Duchardt et al., 2007). Для синтетических щелочных и амфифильных пептидов, содержащих в структуре несколько остатков лизина, была показана не только способность проникать в клетку, но и образовывать комплексы с ДНК и РНК. При этом было установлено, что связывание этих пептидов с ДНК приводит к упрочнению ее двойной спирали (Kubo et al., 2000). Эти олигопептиды также относятся к семейству СРР, так как предназначены для транспортной функции - переноса биологически активных веществ через клеточную мембрану (Morris et al., 2001; Martin et al., 2007; Ferrer-Miralles et al., 2008). Кроме функции переносчика, эти пептиды способны одновременно конденсировать ДНК,
блокировать клеточный метаболизм, проникать в ядро и связывать клеточные рецепторы.
Непосредственное взаимодействие пептида с мембраной определяется электростатическим взаимодействием положительно заряженных боковых групп аминокислотных остатков аргинина и лизина с отрицательными карбоксильными группами фосфатидилсерина, экспонированными на внешней стороне цитоплазматической мембраны (Вешзоу et а1., 1998). Для отрицательно заряженных (карбоксильных) боковых групп пептидов центрами связывания являются положительно заряженные группы фосфатидилхоли-на и фосфатидилэтаноламина. Таким образом, основным механизмом проникновения коротких пептидов через цитоплазматическую мембрану может являться пиноцитоз (рис. 1).
Важным экспериментальным фактом, подтверждающим способность коротких пептидов проникать в клетку, стало исследование, показавшее, что Б1ТС-меченые ди-, три- и тетрапептиды проникают не только в цитоплазму, но и в ядро и ядрышко клеток HeLa. Клетки HeLa инкубировали с Б1ТС-мечеными пептидами 12 часов (Реёогееуа et а1., 2010). При этом в образцах культур клеток под воздействием пептидов флуоресценция была обнаружена в цитоплазме, ядре и ядрышке в виде многочисленных мелких гранул, тогда как в контрольных образцах флуоресценция не наблюдалась (Реёогееуа et а1., 2010). Относительная интенсивность флуоресценции разных меченых пептидов в ядрах клеток HeLa различна. Более сильная флуоресценция была выражена при инкубации клеток с Б1ТС-мечеными пептидами пи-неалоном и эпиталоном, в меньшей степени - с тестагеном. В связи с этим рассмотрим возможный механизм проникновения коротких пептидов в ядро более подробно. Ядро эуариотических клеток имеет систему транспортных пор (нуклео-
Рис. 1. Схема проникновения коротких пептидов в цитоплазму клетки с помощью пиноцитоза и простой диффузии. Черным цветом изображены отрицательно заряженные головки фосфотидилсерина, а серым - положительно заряженные головки фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина.
Рис. 2. Схема строения нуклеопоры (по Alberts et al., 1994).
пор), образованных белковыми комплексами нук-леопоринами. Внутренний диаметр нуклеопор составляет около 50 нм, следовательно, они проницаемы для свободно диффундирующих низкомолекулярных веществ с молекулярной массой до 3,5 кДа (рис. 2) (Ohno et al., 1998).
Таким образом, возможность проникновения коротких пептидов, обладающих характеристиками, перечисленными в таблице (заряд, размер и гидрофобность), через цитоплазматическую и ядерную мембрану является вполне обоснованной. Транспорт веществ определяется сочетанием их стерических и физико-химических свойств.
Из таблицы видно, что размеры молекул мало отличаются и оказываются существенно меньше размеров нуклеопоры. В случае обычной пассивной диффузии менее гидрофильные вещества легче диффундируют через липидный бислой и преимущество, кажется, получает бронхоген. Однако сравнительно высокая гидрофильно сть (тестаген, панкраген, хонлутен) определяется наличием остатков лизина и аргинина, но это также амфифильные фрагменты, способные усиливать, если не транспорт, то предпочтительность ассоциации пептида с мембраной.
Основные характеристики коротких пептидов, разработанных в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии
№ Формула, название Показания к применению Суммарный заряд Молекулярная масса, кДа Индекс гидро-фобности (Kyte et al., 1982)
1 Тимоген Иммуномодулятор (Моттоу et а1., -1 0.333 -4.4
(дипептид) 1998)
2 Вилон Стимулятор регенерации тканей 0 0.275 -7.4
(дипептид) (КИаутвоп et а1., 2000)
3 Нормофтал Регуляция функций сетчатки глаза 0 0.275 -7.4
(дипептид) (Хавинсон и др., 2002)
4 Карталакс Регуляция функции суставов -2 0.333 -5.2
(трипептид) (КИаутвоп et а1., 2008а)
5 Пинеалон Регуляция функций мозга (КИаут- -1 0.418 -11.5
(трипептид) воп et а1., 2009)
6 Хонлутен Регуляция функций дыхательной -2 0.319 -7.4
(трипептид) системы (КИаутвоп et а1., 2008с)
7 Везуген Регуляция функций сосудов -1 0.391 -10.9
(трипептид) (КИаутвоп et а1., 2010)
8 Эпиталон Регуляция нейроэндокринной -2 0.390 -5.6
(тетрапептид) системы (КИаутвоп, 2004)
9 Простамакс Регуляция функции простаты -1 0.488 -12.5
(тетрапептид) (КИаутвоп et а1., 2004)
10 Ливаген Регуляция функции печени (КИау- -1 0.462 -9.1
(терапептид) тв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.