ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 5, с. 544-549
УДК 577.112:579.861.043:535.31
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ РЕАКТИВИРУЮЩЕГО ФАКТОРА
Luteococcus japonicus subsp. casei
© 2009 г. Л. И. Воробьёва*, Е. Ю. Ходжаев*, А. Л. Мулшкин**, И. Ю. Торопыгин***
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Москва, 119899; e-mail: nvvorobjeva@mail.ru **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, РАН, Москва ***Институт биомедицинской химии РАМН им. В Н. Ореховича Поступила в редакцию 30.09.2008 г.
Установлено, что реактивирующий фактор (РФ) Luteococcus japonicus subsp. casei синтезируется конститутивно и его действие происходит по одностадийному механизму: для его активации стрессовое воздействие не требуется. Реактивация клеток как реверсия способности к образованию макроколоний, по-видимому, обусловлена мембранным механизмом действия РФ, о чем свидетельствует зависимость антистрессовой активности от состояния цитоплазматической мембраны и характер концентрационной зависимости. Инкубация облученных УФ суспензий L. casei с РФ сопровождалась увеличением численности клеток с интактной барьерной мембраной (в 1.6-1.8 раз по сравнению с необработанными РФ суспензиями), что коррелировало с ростом числа колониеобразующих клеток. Показано перекрестное защитное и реактивирующее действие РФ в отношении как клеток L. casei, так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. При этом имела место конкуренция РФ бактерий и дрожжей за мембранные рецепторы. Методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) установлено, что РФ L. casei содержит два основных пептида с молекулярной массой 5.8 и 7.6 кДа, а РФ S. cerevisiae представлен пептидом с 5.8 кДа. Наличие в составе РФ бактерий и дрожжей пептида с 5.8 кДа может обуславливать перекрестные ответы у этих микроорганизмов.
Стрессовые ответы бактерий вызывают большой интерес, поскольку их устойчивость к стрессам создает серьезные проблемы в антимикробной терапии и биотехнологии [1]. Исследования последних лет показали, что большая часть стрессовых ответов микроорганизмов опосредуются участием внеклеточных факторов, которые называют сенсорами, сигнальными молекулами, феромонами.
Участие внеклеточных молекул пептидной природы в формировании стрессовых ответов у бактерий было впервые показано в работах Р. Роубери и сотрудников [2-5]. Установлено, что клетки Escherichia coli, не подверженные стрессу, образуют de novo и секретируют в среду белковые соединения -внеклеточные сенсорные компоненты (ВСК), которые могут активироваться при слабом нагревании, УФ-облучении и других стрессорных воздействиях, превращаясь во внеклеточный индуцирующий компонент (ВИК). Он взаимодействует с клеткой-мишенью, активируя те же регуляторы, которые включают стрессовый ответ. Согласно [3], ВСК выступают как внеклеточные сенсоры и служат первоначальной мишенью стрессового воздействия. Однако эти сигнальные белковые молекулы не были идентифицированы, а заключение о дву-стадийном механизме их действия (ВСК —ВИК) базировалось на результатах физиологических экспериментов, проводимых, главным образом, с E. coli 1829.
Для E. coli также известны внеклеточные факторы xI и хп, образующиеся в условиях стресса под действием N-этилмалеимида (N-ЭМ) [6]. Первый из них - xI, обеспечивает прямую коллективную защиту клеток от литического действия N-ЭМ; фактор хп представлен сигнальными молекулами, которые выделяются в среду в условиях сильного стресса, вызывающего резкое снижение роста. Фактор xI неустойчив при нагревании и хранении, а фактор хп стабилен в этих условиях и, возможно, является средством межклеточной коммуникации. Однако, природа и механизмы действия этих факторов не ясны [6].
Изучены свойства и функции внеклеточных белков семейства Rpf, обнаруженные в культуральной жидкости активно растущих клеток Micrococcus lu-teus. Основной функцией этих белков является восстановление колониеобразующей способности у не-культивируемых клеток ("оживление") [7]. Ген rpf был выделен и полностью расшифрован у M. luteus, а также ряда других бактерий. Предполагается, что Rpf является ферментом, обладающим лизоцим-по-добной активностью, и механизм его действия связан с модификацией клеточной стенки [8].
В наших исследованиях впервые было показано, что белковые экзометаболиты бактерий и дрожжей участвуют в реактивации клеток, подверженных действию различных стрессорных факторов (УФ-облучения, нагревания, окислительного стрес-
Таблица 1. Соотношение интактных и поврежденных клеток в суспензиях Ь.саш до и после облучения УФ и реактивации с РФ
Суспензия Ь. сазв^ Общее число клеток, хШ7/мл Доля клеток
тест Live/Dead % тест с пропидиум-иодидом %
До облучения УФ 4.34 ± 1.3G Живые 96 Интактные 94
Переходные G Поврежденные G
Мертвые 4 Мертвые 6
После облучения УФ 1.65 ± G.51 Живые 12 Интактные S
и инкубации в бу- Переходные 39 Поврежденные 42
ферном растворе** Мертвые 49 Мертвые 5G
После облучения УФ 4.31 ± 1.9G Живые SS Интактные 22
и инкубации с РФ Переходные 6 Переходные 59
Мертвые 6 Мертвые 19
* Для культур в логарифмической фазе роста. ** Здесь и далее 0.05 М ^-фосфатный буферный раствор (рН 7.4).
са) [9-12]. Важно отметить, что реактивация стрес-сированных клеток в присутствии этих метаболитов особенно эффективна при сильных воздействиях, приводящих почти к полной гибели микроорганизмов [9, 10]. Реактивирующая активность была изначально обнаружена у клеток Ьшвососсш ]аротсш subsp. саяв1, филогенетически родственных пропио-новокислым бактериям [13]. Показано, что Ь. са8в1 конститутивно образует реактивирующий фактор (РФ) белковой природы, участвующий в реактивации и защите клеток, подвергавщихся разным стрес-сорным воздействиям [9, 10]. С другой стороны, действие РФ неспецифично в отношении различных грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжей [11, 12].
В проводимых до настоящего времени исследованиях изучали, в основном, биологические свойства РФ.
Цель работы - изучение механизма антистрессового действия РФ.
МЕТОДИКА
Объектом исследований были грамположи-тельные бактерии Ьшвососсш ]аротсш subsp. casвi (Ь. сазвР), выделенные из сыра и описанные ранее [13], а также дрожжи БассНаготусвз cвrвvisiaв. Выращивание Ь. casвi проводили в статических условиях при 30°С на глюкозо-минеральной среде следующего состава (%): глюкоза - 1.5, (NH4)2SO4 - 0.3, - 0.1, №2ШЮ4 - 0.2, Caa2 - 0.002, MgSO4 -0.002, ша - 0.002, ^а2 • 6H2O - 0. 0001, триптон ("Difco", США) - 0.1, дрожжевой экстракт ("Difco", США) - 0.05, дистиллированная вода, рН 7.0. Кислоты, образующиеся в процессе роста бактерий, периодически нейтрализовали 5%-ным раствором NаOH.
Дрожжи выращивали на сусле 4° по Баллингу (pH 6.5) в аэробных условиях. Клетки бактерий и дрожжей отделяли от среды центрифугированием (6000 g, 20 мин), промывали 0.05 М №-фосфатным буферным (рН 7.4) раствором и суспендировали в
том же буфере. Полученные клеточные суспензии служили объектом для стрессорных воздействий. Отделенную от клеток L. casei и S. cerevisiae культу-ральную жидкость (КЖ) использовали в качестве источника РФ и протекторных факторов. Реактивирующая активность КЖ была обусловлена белковым экзометаболитом - РФ, выделенным но ранее описанным методикам [9-11].
Численность жизнеспособных клеток в суспензиях L. casei и S. cerevisiae определяли но титру ко-лониеобразующих единиц (КОЕ/мл) после высева Ю^кратно разведенных суспензий на соответствующие плотные среды с 1.5%-ным агаром. Для посева использовали микрометод с внесением аликвот суспензий объемом 5 мкл в шестикратной повторности для каждого разведения. Посевы инкубировали при 30°С в течение 72 ч.
Микроскопические наблюдения проводили в режимах фазового контраста и эпифлуоресценции с использованием микроскопа Axioplan (Carl Zeiss, Германия). Клеточные суспензии (5 мкл) инкубировали с таким же объемом двухкомпонентного красителя Live/Dead Baclight kit (Molecular Probes Inc., США) в соответствии с рекомендациями производителя. Окрашенные клеточные суспензии инкубировали в темноте при З7°С в течение 1G мин. "Живыми" в тесте с Live/Dead считали клетки с зеленой и желтой флуоресценцией, "мертвыми" - с красной. Параллельно суспензии клеток прокрашивали иодистым пронидием в конечной концентрации 3 мкМ и инкубировали аналогичным образом. В тесте с этим красителем "живыми" считали клетки, не обладающие красным свечением и видимые только при фазовом контрасте, а также клетки с фоновой флуоресценцией; "мертвые" - с ярко красным свечением. Подсчет клеток проводили но результатам просмотров не менее 2G нолей зрения для каждого препарата. В таблицах 1 и 3 представлены усредненные данные но процентному соотношению "живых" и "мертвых" клеток.
Таблица 2. Реактивирующее действие РФ на облученные УФ клетки Ь. casвi в логарифмической и стационарной фазах роста
Суспензия L. casei Численность жизнеспособных клеток, х105 КОЕ/мл Выживаемость, % Индекс деления
Клетки в стационарной фазе роста
До облучения УФ 200 ± 12.2 100 -
После облученияУФ, инкубируемая в 0.12 ± 0.013 0.06 1.0
буферном растворе
После облучения УФ и инкубации с РФ 0.22 ± 0.016 0.11 1.8
Клетки в логарифмической фазе роста
До облучения УФ 175 ± 13.7 100 -
После облучения УФ, инкубируемая в 0.12 ± 0.015 0.07 1.0
буферном растворе
После облучения УФ и инкубации с РФ 0.47 ± 0.058 0.27 3.9
Таблица 3. Определение численности живых и мертвых клеток в суспензиях S. cerevisiae контрольного варианта, подвергнутых облучению УФ и реактивированных внесением препарата РФ (тест с красителем Live/Dead)
Суспензия S. cerevisiae Общая численность клеток, кл./мл Доля клеток, %
живые переходные мертвые
До облучения (3.4 ± 1.8) х 107 86 10 4
После облучения УФ (3.7 ± 1.9) х 107 53 8 39
После облучения УФ и инкубации с РФ (2.5 ± 1.5) х 107 76 16 8
Определение стрессопротекторной и реактивирующей активности РФ. Суспензии клеток бактерий или дрожжей подвергали УФ-облучению на установке из двух параллельно смонтированных ламп БУВ-15 (Россия) мощностью 30 Вт, с эмиссией в области 253.7 нм. Для подбора доз облучения проводили предварит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.