БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 1, с. 22 - 32
УДК 577.21
МЕХАНИЗМ ГИБЕЛИ ДРОЖЖЕЙ ЗасскагошусеБ сегег1Б1ае ПРИ ТЕПЛОВОМ ШОКЕ. ВЛИЯНИЕ ЦИКЛОГЕКСИМИДА НА ЭТОТ ПРОЦЕСС*
© 2014 г. Е.Г. Рихванов, И.В. Федосеева**,
Н.Н. Варакина, Т.М. Русалева, А.В. Федяева
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033Иркутск, ул. Лермонтова, 132; факс: (3952)510-754, электронная почта: fedoseeva@sifibr.irk.ru
Поступила в редакцию 08.08.13 После доработки 24.09.13
Показано, что механизм гибели дрожжевых клеток при тепловом шоке зависит от интенсивности теплового воздействия. Умеренный (45°) тепловой шок приводил к значительному усилению генерации активных форм кислорода (АФК) и гибели клеток. Предварительная обработка циклогексимидом (при 30°) подавляла гибель, но не влияла на продукцию АФК. Если же циклогексимид добавляли непосредственно перед тепловым воздействием и инкубировали с ним во время восстановительного периода, то протекторный эффект отсутствовал. Протекторное влияние циклогексимида на жизнеспособность, а также продукция АФК значительно снижались при действии жесткого (50°) теплового шока. Обработка циклогексимидом при 39° ин-гибировала индукцию синтеза Н5р104 и подавляла развитие индуцированной термотолерантности к жесткому шоку (50°), но не влияла на развитие устойчивости при действии умеренного (45°) теплового шока. В то же время, Н5р104 эффективно защищал клетки от гибели независимо от интенсивности воздействия. Полученные данные указывают, что при умеренном тепловом шоке гибель клеток дрожжей происходит в результате развития программируемой клеточной гибели (ПКГ), а циклогексимид ингибирует этот процесс, подавляя общий белковый синтез.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: циклогексимид, Saccharomyces cerevisiae, термотолерантность, Н5р104, активные формы кислорода, программируемая клеточная гибель.
Способность дрожжей выдерживать кратковременное действие повреждающих температур определяется их базовой термотолерантностью. Если клетки подвергнуть кратковременному мягкому тепловому воздействию при 37—39° (тепловой стресс), то в них синтезируются белки теплового шока и повышается способность выдерживать повреждающее тепловое воздействие (тепловой шок). Этот феномен известен как индуцированная или приобретенная
Принятые сокращения: БТШ — белки теплового шока; Hsp104 — белок теплового шока 104 (heat shock protein 104); Dnml — динамин 1 (dynamin 1), гомолог белка животных; Yca1 (MCA1) — метакаспаза дрожжей (yeast cas-pase 1); ПКГ — программируемая клеточная гибель; АФК — активные формы кислорода; H2DCFDA — 2',7'-дихлор-флуоресцеин диацетат (2',7'-dichlorofluorescin diacetate); DCF — 2',7'-дихлорфлуоресцеин (2',7'-dichlorofluorescin); ДДС — додецилсульфат натрия.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-232, 24.11.2013.
** Адресат для корреспонденции.
термотолерантность [1, 2]. Зависимость между появлением в клетке БТШ и термотолерантностью заставила искать причинно-следственную связь между этими явлениями. Согласно работе МакАлистер и Финкельштейн [3], подавление индукции синтеза БТШ в результате обработки циклогексимидом, ингибитором белкового синтеза, снижало развитие индуцированной термотолерантности в клетках Saccharomyces cerevisiae. Подавляющее воздействие циклогексимида на это явление, используя тот же самый объект, подтвердили и другие авторы [4, 5]. Эти факты указывали на то, что синтез белков de novo является необходимым условием для развития индуцированной термотолерантности. В то же время зависимость между индукцией синтеза БТШ и индуцированной термотолерантностью не всегда была очевидной. Другие исследователи не зарегистрировали негативного влияния циклогекси-мида на индуцированную термотолерантность у дрожжей [6, 7]. Противоречивые результаты воздействия циклогексимида заставили сомне-
ваться, имеют ли БТШ защитную функцию или же эти белки, по выражению В.Я. Александрова и И.М. Кислюка [1], представляют собой «коленный рефлекс клетки на раздражитель»? Получение мутантов S. cerevisiae, которые не синтезируют БТШ, положило конец дебатам относительно роли БТШ в термотолерантности. Утрата гена HSP104 [2] или подавление его экспрессии [8] снижали способность клеток S. cerevisiae выдерживать летальный тепловой шок. Белок Hsp104 способствует дезагрегации и ренатура-ции поврежденных белков, повышение его количества является одним из основных факторов, определяющих индуцированную термотолерантность у дрожжей [2, 9]. Однако причины противоречивых результатов действия циклогексими-да на индуцированную термотолерантность остаются неизвестными до сих пор.
Тепловой шок может вызывать развитие программированной клеточной гибели (ПКГ) в клетках млекопитающих [10]. ПКГ представляет собой специфичную программу самоубийства, которая характеризуется перераспределением фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный, конденсацией хроматина, фрагментацией ДНК, увеличенным образованием активных форм кислорода (АФК), фрагментацией митохондрий и выходом цитохрома с из митохондрий в цито-золь [11]. Ряд косвенных данных указывает на то, что и в клетках дрожжей S. cerevisiae при действии теплового шока может наблюдаться развитие ПКГ. Гетерологичная экспрессия анти-апоптозных белков семейства Bcl-2 защищала дрожжи от гибели при повышении температуры [12]. В клетках дрожжей обнаружен ряд белков, участвующих в развитии ПКГ, и их утрата подавляет этот процесс. Это такие белки, как: Yca1 — Са2+-зависимая цистеиновая протеаза; Dnm1 — гомолог белка животных (Drp1, dynamin related protein), ответственный за дробление митохондрий; Nma111 (nuclear mediator of apoptosis) — ор-толог митохондриальных сериновых протеаз животных; Ndi1 (NADH dehydrogenase internal) — внутренняя NADH-дегидрогеназа; Mmi1 (microtubule and mitochondria interacting protein) — гомолог человеческого белка TCTP (translationally controlled tumor protein); Tat-D (twin arginine translocation D, YBL055C) — нуклеаза; Stm1 (suppressor of Tom1) — белок, участвующий в трансляции. Одновременно утрата указанных белков защищала клетки от гибели при действии теплового шока [13, 14]. Наоборот, утрата белка Bxi1, гомолога антиапоптозного белка млекопитающих Bi-1 (Bax inhibitor-1), снижала термотолерантность дрожжей, а также делала клетки восприимчивыми к этанолу при использовании его в
качестве индуктора ПКГ [15]. Однако остается неизвестным, может ли тепловой шок вызывать ПКГ в клетках дрожжей.
Одним из описанных физиологических эффектов циклогексимида является его способность подавлять ПКГ. Показано, что обработка циклогексимидом подавляла развитие ПКГ в клетках дрожжей при действии низких концентраций пероксида водорода [16], уксусной кислоты [17] и а-фактора [18]. Высокие концентрации пероксида водорода и уксусной кислоты вызывали гибель клеток в результате некроза, которая не подавлялась циклогексимидом [16, 17]. Поэтому предотвращение гибели клетки в результате действия циклогексимида рассматривается как специфический индикатор, позволяющий отличить ПКГ от некроза [16—18].
Исходя из вышеизложенного, логично предположить, что в клетках дрожжей, так же как и в клетках млекопитающих [10], в зависимости от интенсивности теплового воздействия гибель может происходить либо в результате ПКГ, либо в результате некроза. Соответственно, в первом случае гибель будет подавляться циклогексими-дом, а во втором — нет. Авторы, изучавшие влияние циклогексимида на развитие индуцированной термотолерантности, не принимали во внимание, что механизмы гибели клеток дрожжей при тепловом шоке могут различаться. Поэтому целью данной работы являлось изучение влияния циклогексимида на базовую и индуцированную термотолерантность & еегеу1$1ае в зависимости от интенсивности теплового воздействия.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные штаммы дрожжей и условия культивирования. В работе использовали дрожжи S. cerevisiae штамм родительского типа ¥-74-D694 (MATa, ade1-14(UGA), trp1-289(UAG), his3A-200, ura3-52, leu2-3,112 [PS/+]) и изогенный ему мутант ¥-74-D694::hspA-1L (MATa, ade1-14(UGA), trp1-289(UAG), his3A-200, ura3-52, HSP104::LEU2), любезно предоставленные S. Lindquist (Институт биомедицинских исследований, Уайтхед, США). Дрожжи поддерживали на среде YEPD (дрожжевой экстракт — 5 г/л, пептон — 10 г/л, глюкоза — 20 г/л и агар — 15 г/л) при 30°. Дрожжи выращивали в течение 14—16 ч при 30° в колбах емкостью 100 мл с 25 мл жидкой среды YEPD. Для проведения экспериментов определенный объем 14-часовой культуры вносили в свежую питательную среду и инкубировали до достижения концентрации 2 х 107 клеток/мл.
Выделение суммарного белка и вестерн-блот-тинг. Для выделения суммарного белка клетки
дрожжей осаждали центрифугированием, промывали и хранили при —70° до момента выделения белка. Перед выделением белка клетки размораживали, ресуспендировали в буфере для выделения белка (0,1 М Tris-HCl; 3 мМ ДДС; 1 мМ Р-меркаптоэтанол; pH 7,4—7,6), замораживали жидким азотом и растирали с кварцевым песком. Грубые клеточные компоненты удаляли центрифугированием (15 000 g, 15 мин), белок осаждали трехкратным объемом холодного ацетона. Осадок белка трижды промывали ацетоном и растворяли в буфере для образца (0,625 М Tris-HCl; 8 мМ ДДС; 0,1 М Р-меркаптоэтанол; 10%-ный глицерин; 0,001%-ный бромфеноло-вый синий; pH 6,8). Концентрацию белка определяли по методу Лоури с соавт. [19]. После разделения белков путем ДДС-электрофореза в 12%-ном ПААГ проводили иммуноблоттинг с антителами против Hsp104 (SPA-8040, «StressGen», США) и Hsp60 (US Biological H1830-77B, США) в соответствии с ранее опубликованным методом [20].
Подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ). Для подсчета КОЕ дрожжевые клетки разводили стандартным образом и высевали на среду YEPD, содержавшую 1,5% агара. Через 24—48 ч инкубирования при 30° подсчитывали количество образованных КОЕ, и данные представляли как процент от контроля в трех независимых экспериментах.
Определение генерации активных форм кислорода (АФК). Для определения генерации АФК использовали флуоре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.