УДК 612.821
МЕХАНИЗМ ИЗМЕНЕНИЯ СКОРОСТИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПОД ВЛИЯНИЕМ АДРЕНАЛИНА © 2014 г. А. И. Володченко1, В. И. Циркин2, А. А. Костяев3
1Вятский государственный гуманитарный университет, Киров 2Казанский государственный медицинский университет 3ФГУ Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России E-mail: strelnikovaai@mail.ru Поступила в редакцию 06.06.2012 г.
При исследовании эритроцитов крови 80 мужчин установлено, что адреналин (10-10—10-6 г/мл) и фенилэфрин (10-10—10 г/мл) дозозависимо повышают скорость агглютинации эритроцитов, судя по уменьшению времени начала агглютинации, а гинипрал (10-10—10-7 г/мл), наоборот, снижает ее. Эффект адреналина и фенилэфрина блокируется ницерголином (10-6 г/мл), усиливается обзида-ном (10-6 г/мл) и не изменяется под действием йохимбина (10-6 г/мл) и атенолола (10-6 г/мл). Эти данные указывают на то, что скорость агглютинации возрастает при активации aj-адренорецепто-ров (АР) и снижается при активации в2-АР, в то время как активация a2- и Рх-АР не влияет на нее. Трифлуоперазин (10-6 г/мл) как антагонист кальмодулина, хлорид бария (10-6 г/мл) как блокатор Са -зависимых К+-каналов, и индометацин (10-6 г/мл), как ингибитор циклооксигеназы и фосфо-липазы А2, препятствуют способности адреналина повышать скорость агглютинации эритроцитов. Это позволяет считать, что данный эффект адреналина обусловлен повышением входа в эритроцит Са2+, активацией кальмодулина, циклооксигеназы, фосфолипазы А2 и выходом К+ из эритроцита через Са2+-зависимые К+-каналы, что расценивается как проявление эриптоза. Косвенно это означает, что повышение эффективности активации aj-АР и в2-АР соответственно повышает или, наоборот, снижает скорость эриптоза.
Ключевые слова: эритроциты, агглютинация, адреналин, адреноблокаторы, индометацин, трифлу-операзин, хлорид бария.
DOI: 10.7868/S0131164614010202
Ранее было показано [1—3], что в условиях in vitro адреналин, как правило, повышает скорость агглютинации эритроцитов человека, хотя в отдельных случаях он не изменяет ее или даже снижает. Исходя из данных о существовании в эритроцитах популяций ах-, а2-, р^ и р2-адрено-рецепторов (АР) [4], Циркин В.И. и соавт. [1] высказали предположение о том, что увеличение скорости агглютинации под влиянием адреналина связано с активацией а-АР и, частично, р2-АР, а ее снижение — с активацией Pi-АР. Однако убедительных доказательств этого предположения до настоящего времени не было.
Целью настоящей работы являлось изучение роли адренорецепторов в реализации способности адреналина повышать скорость агглютинации эритроцитов и механизма, лежащего в основе этой способности.
МЕТОДИКА
Исследовали венозную кровь 100 мужчин-доноров в возрасте от 18 до 30 лет, имеющих II
(78%), III (22%) или IV (6%) группу крови по системе АВ0. Кровь получали на станции переливания крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови в объеме 2—4 мл и смешивали ее с гепарином (50 Ед/мл раствора Кребса) в соотношении 4 : 1. Оценку влияния адреналина (10-10— 10-6 г/мл), фенилэфрина (10-10—10—6 г/мл) или ги-нипрала (10-10—10-7 г/мл) на агглютинацию эритроцитов проводили по методу Циркина В.И. и соавт. [1]. С этой целью на плоскость наносили 3 капли: 1) каплю гепаринизированной крови, 2) каплю раствора Кребса (контроль) или каплю адренергического вещества в одной из исследуемых концентраций (опыт), 3) каплю изогемаг-глютинирующей сыворотки 0aß (I) группы. Затем смешивали стеклянной палочкой первую и вторую капли, а через 10 секунд к ним примешивали каплю сыворотки, и с этого момента определяли время начала агглютинации (ВНА) эритроцитов по появлению ее первых визуальных признаков — "зернышек" агглютината. В контроле (раствор Кребса) ВНА оценивали в секундах, а в опыте — в секундах и процентах к контролю.
а, ф
%
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Рис. 1. Время начала агглютинации (% от контроля) эритроцитов мужчин в изогемагглютинизирующей сыворотке 0ар (I) группы крови в присутствии адре-
п—10
10 6 г/мл, 1-е столбцы), фенилэф-
10 6 г/мл, 2-е столбцы) и гинипрала
налина (10 рина (10-10, (10-10, ..., 10-7 г/мл, 3-и столбцы). *, А, Ф — различия с контролем (*), группами "Адреналин" (А) и "Фенилэфрин" (Ф) статистически значимы (р < 0.05) по критерию Манна—Уитни.
Для определения влияния на эффект адреналина различных веществ — обзидана, атенолола, ницерголина, йохимбина, индометацина, триф-луоперазина и хлорида бария (все — в концентрации 10-6 г/мл), предварительно, в течение 5 минут при комнатной температуре гепаринизирован-ную кровь в объеме 0.75 мл инкубировали с 0.25 мл раствора одного из указанных веществ (3 : 1). Затем проводили все описанные выше процедуры с неинкубированной и инкубированной кровью. Для исключения влияния веществ, находящихся в сыворотке крови, на процесс агглютинации, была проведена серия опытов на отмытых эритроцитах, а также на эритроцитах, инкубированных в сыворотке крови того же донора. Для этого исходно определяли ВНА в растворе Кребса и исследовали адренореактивность эритроцитов цельной крови. Затем эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием в течение 10 минут при 1500 об/мин, трижды отмывали в физиологическом растворе и определяли ВНА эритроцитов в присутствии раствора Кребса или адреналина в исследуемых концентрациях. Эти же параметры определяли для отмытых эритроцитов, которые в течение 5 минут экспонировали в сыворотке крови того же донора.
В работе использовали адреналина гидрохлорид (Московский эндокринный завод, Россия), а1-адреномиметик фенилэфрин (10-10—10—6 г/мл, "Дальхимфарм", Россия), р2-адреномиметик гинипрал (10-10-10-7 г/мл, "Никомед", Австрия), неселективный блокатор а-АР ницер-голин (10-10—10-6 г/мл, ФП "Оболенское", Россия), селективный блокатор а2-АР йохимбина гидрохлорид (10-6 г/мл, "Здоровье", Россия), неселективный блокатор р-АР обзидан (10-10-
10-6 г/мл, "Шварц Фарма АГ", Германия), селективный блокатор р1-АР атенолол (10-1010-6 г/мл, "Канофарма Продакшн", Россия), блокатор фосфолипазы А2 и циклооксигеназы индометацин (10-6 г/мл, "Фармахим-Софарма", Болгария), антагонист кальмодулина трифлуопе-разин (10-6 г/мл, "Здоровье", Украина) и блокатор Гардош-эффекта ВаС12 (10-6 г/мл, "Синтез", Россия). Все разведения веществ готовили на растворе Кребса, содержащем (мМ): NaCl — 136; KC1 — 4.7; CaC12 - 2.52; MgC12 - 1.2; KH2PO4 - 0.6; NaHCO3 - 4.7; C6H12O6 - 11. (рН = 7.4). Во всех опытах использовали изогемагглютинирующую сыворотку группы 0ар (I). Определение группы крови проводили общепринятым способом [5], используя стандартные изогемагглютинирующие сыворотки группы 0ар (I), Ар (II) Ва (III). Все сыворотки произведены Кировской областной станцией переливания крови (титр 1 : 32). Всего проведено 250 опытов.
Результаты исследования подвергнуты статистическому анализу с использованием программы SPSS 11.5.0 (в тексте они представлены в виде M ± m). Различия между значениями в контроле и опыте, а также между независимыми выборками (группами "Адреналин", "Фенилэфрин" и "Гинипрал", а также между группами "эритроциты цельной крови", "отмытые эритроциты" и "эритроциты + сыворотка") оценивали по критерию Мана-Уитни, а различия между значениями до и после инкубации - по критерию Вилкоксона, считая их статистически значимыми при р < 0.05 [6]. Зависимость эффекта адреналина или фенил-эфрина от их концентрации оценивали по критерию ранговой корреляции Спирмена [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установлено (рис. 1), что адреналин в концентрациях 10-10—10—6 г/мл, как правило, дозозави-симо снижает ВНА. Судя по суммарным результатам, рассчитанным для 90 опытов с адреналином, ВНА уменьшилось соответственно до 91%*, 84%*, 83%*, 79%* и 78%* от контроля (* - различие с контролем статистически значимо, р < 0.05 по критерию Манна-Уитни). Выявлено, что эффект адреналина зависит от его концентрации -критерий Спирмена составил -0.413 (р < 0.05).
Показано, что ницерголин (10-6 г/мл) полностью блокировал способность адреналина снижать ВНА (рис. 2, А). В то же время йохимбин (10-6 г/мл, рис. 2, Б) и атенолол (10-6 г/мл, рис. 2, В) не влияли (р > 0.05) на нее, а обзидан (10-6 г/мл; рис. 2, Г) статистически значимо усиливал ее (р < 0.05). Это позволяет утверждать, что активация а1-АР повышает скорость агглютинации, а активация р2-АР снижает ее. Активация а2-АР и р1-АР, скорее всего, не имеет отношения к изменению скорости агглютинации под влиянием адреналина.
%
120
110
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
0
%
110
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
0
%
110
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
0
%
110
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
0
А
а й
а
10
8 В
10 9
а а
* г^ *
8 7
Д
а а
а
%
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
0
%
110 100
0
%
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Б
10
8 Г
10
г а * а
876 Е
а
а
аа
10
8
Ж
а
10
876
а
10
Рис. 2. Время начала агглютинации эритроцитов в присутствии адреналина (в % от контроля): исходное (1-е столбцы) и после 5-минутной экспозиции с ницерголином (10-6 г/мл, панель А, 2-е столбцы), йохимбином (10-6 г/мл, панель Б, 2-е столбцы), атенололом (10-6 г/мл, панель В, 2-е столбцы), обзиданом (10 6 г/мл, панель Г, 2-е столбцы), индо-метацином (10-6 г/мл, панель Д, 2-е столбцы), трифлуоперазином (10 6 г/мл, панель Е, 2-е столбцы) и хлоридом бария (10-6 г/мл, панель Ж, 2-е столбцы). * и А — различия с контролем и группой "Адреналин" статистически значимы (р < 0.05) по критерию Вилкоксона.
6
6
9
7
9
7
6
9
6
9
7
9
6
9
8
7
Таблица 1. Время начала агглютинации эритроцитов мужчин (М ± т) в изогемагглютинизирующей сыворотке 0ар (I) группы крови в присутствии раствора Кребса (контроль, секунды), адренергических и других веществ (опыт, % от контроля)
Вещества и их концентрация (г/мл) п Контроль Концентрация вещества, г/мл
10-10 10-9 10-8 10-7 10-6
с % % % % %
Фенилэфрин и адреноблокаторы
Фенилэфрин 10 11 ± 1 91 ± 2* 83 ± 1* 81 ± 2* 75 ± 2* 70 ± 3*
Ф + ницерголин, 10-6 10 11 ± 1 102 ± 1Ф 99 ± 2Ф 101 ± 1Ф 103 ± 1Ф 101 ± 2Ф
Ф + обзидан, 10-6 10 11 ± 1 89 ± 2* 83 ± 2* 83 ± 2* 79 ± 2* 75 ± 2*
Гинипра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.