НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 2, с. 154-157
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 581.17
МЕХАНИЗМ НЕЙРОЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БЛОКАТОРА Ка+/Ы+-ОВМЕНА 5-(К-ЭТИЛ-К-ИЗОПРОПИЛ)-АМИЛОРИДА (Е1РА) В КУЛЬТУРЕ ЗЕРНИСТЫХ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА КРЫС
© 2014 г. Е. В. Стельмашук1, *, С. В. Новикова1, Г. А. Амелькина2, Е. Е. Генрихе1,
Л. Г. Хаспеков1, Н. К. Исаев 1 2
1ФГБУ "Научный центр неврологии"РАМН 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского
Экспозиция в течение 24 ч культивированных зернистых нейронов мозжечка крыс (КЗН) с ингибитором №+/Н+-обмена плазмолеммы 5-(М-этил-М-изопропил)-амилоридом (Е1РА) вызывала интенсивную гибель этих нейронов. Менадион и антиоксидант тролокс препятствовали нейроцито-токсическому действию Е1РА. Ранее мы показали, что менадион защищает КЗН от гибели, вызванной ингибированием комплекса I дыхательной цепи митохондрий [11]. Возможно, блокада комплекса I является основной причиной гибели нейронов, вызываемой Е1РА. Кроме того, в механизм нейродеструктивного эффекта Е1РА может быть вовлечен процесс перекисного окисления липидов.
Ключевые слова: Е1РА, культивированные зернистые нейроны мозжечка, менадион, тролокс.
Б01: 10.7868/81027813314020113
ВВЕДЕНИЕ
Изменения функционального состояния клетки в норме часто сопровождаются колебаниями значений внутриклеточного рН (рН^) в довольно узком интервале в пределах 0.1—0.16 единиц [1, 2], что требует мощной внутриклеточной системы поддержки этого важного показателя. В механизмах регуляции рН; ведущую роль играют системы транспорта ионов водорода через плазматическую мембрану, важнейшей из которых является №+/Н+-обменник [3], а его ингибитор 5-(М-этил-М-изопропил)-амилорид (Е1РА) [4] используется как инструмент исследования роли этой транспортной системы в развитии патологических процессов. Обнаружено, что блокада №+/Н+-обменника и ослабление активации аст-роцитов и микроглии под действием Е1РА предотвращает повреждение нейронов гиппо-кампа, вызванное ишемией/реперфузией головного мозга монгольских песчанок [5, 6]. Однако защитный эффект Е1РА может быть связан не только со снижением рН;, следствием которого является усиление работы №+/Са2+-обменника, уменьшающего содержание Са2+ в клетке, но и со
*Адресат для корреспонденции: 125367 Москва, Волоколамское шоссе, 80; тел. +7(495)917-84-52, факс: +7(495)939-31-81; e-mail: estelmash@mail.ru.
способностью EIPA блокировать NMDA-рецеп-торы [5, 7]. В то же время, длительное ингибиро-вание №+/Н+-обменника под влиянием EIPA индуцирует независимую от каспаз гибель нейронов [8]. Хотя морфологические критерии этой гибели были достаточно полно охарактеризованы, первичная причина ее запуска остается неизвестной. Целью настоящей работы было выяснение механизма нейроцитотоксического действия EIPA.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все среды и добавки к ним, использованные для клеточных культур, были получены от Biochrom KG Berlin (Germany), другие реагенты — от Sigma Chemicals (Germany).
Первичные культуры мозжечка. Исследование выполнено на 3- и 7-8-дневных культурах зернистых нейронов мозжечка 8-суточных крыс линии Вистар. Для получения суспензии клеток, используемой для культивирования, выделенные мозжечки измельчали в фосфатном буфере (PBS), лишенном ионов кальция и магния. Полученные фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°C в PBS, содержащем 0.05% трипсина и 0.02% ЭДТА, затем промывали в двух сменах PBS и 1 раз в питательной среде и подвергали в ней механической диссоциации. Питательная среда содержала
МЕХАНИЗМ НЕЙРОЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БЛОКАТОРА
155
10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера НЕРЕ8, pH 7.2—7.4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок ре-суспендировали в питательной среде. Культивирование проводили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полилизином. В каждую ячейку планшета добавляли 0.1 мл суспензии клеток. Культуры помещали в СО2-инкубатор, заполненный газовой смесью (95% воздуха, 5% СО2), при температуре 36.5°C и относительной влажности 98%. На 2-й день in vitro (DIV) среду заменяли свежей, содержащей 25 мМ KCl, в которой клетки культивировали без смены среды до 3 или 7—8 DIV
Обращение с животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с интернациональным руководством заботы о животных.
Оценка выживаемости нейронов. После эксперимента культуры фиксировали в смеси этанол— формальдегид—уксусная кислота (7 : 2 : 1) и окрашивали трипановым синим. Процент выживших культивированных зернистых нейронов (КЗН) мозжечка оценивали путем подсчета интактных ядер КЗН в 5 полях зрения при увеличении объектива х40. Выживаемость нейронов в необработанных (контрольных) культурах принимали за 100%, выживаемость в экспериментальных культурах выражали в процентах относительно контроля.
Статистический анализ. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с посттестом Bonferroni или Dunnett, при уровне значимости p < 0.05. Результаты выражали как среднее ±SEM. Все данные получены не менее чем на 6-ти культурах из 2-3-х независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для ингибирования №+/Н+-обмена цито-плазматической мембраны в среду культивирования вносили на 24 ч 0.01 мМ 5-^-этил^-изо-пропил)-амилорида (EIPA), что индуцировало в нейрохимически зрелых культурах (7—8 DIV) интенсивную гибель КЗН (рис. 1а), выживаемость которых составляла всего 30 ± 3% по сравнению с контролем (рис. 1б). Присутствие менадиона (витамина К3, 0.003 мМ) в течение всего периода обработки EIPA значительно, до 89 ± 3%, повышало выживаемость КЗН (рис. 1б). Подобный защитный эффект оказывал и липидно-растворимый аналог антиоксиданта витамина Е тролокс (0.1 мМ, рис. 1а), в присутствии которого выживаемость нейронов на фоне токсического действия EIPA повышалась до 96 ± 3% (рис. 1б). Селективный хелатор ионов цинка TPEN (5 мкМ) не оказывал защитного эффекта (рис. 2).
Нейрохимически незрелые нейроны, культивированные в течение 3 DIV, реагировали на ток-
сическое действие 0.01 мМ EIPA немного слабее, чем зрелые, развивавшиеся в течение 7 DIV. Через 24 ч после внесения в среду инкубации EIPA в незрелых культурах выживало 45 ± 4% нейронов (рис. 3). Менадион (0.003 мМ) и тролокс (0.1 мМ) значительно, до 76 ± 5 и 85 ± 7%, соответственно, повышали выживаемость незрелых КЗН в условиях обработки EIPA (рис. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В наших экспериментах при действии EIPA происходила интенсивная гибель КЗН, которая предотвращалась менадионом. Известно, что менадион в низких концентрациях способен шунтировать перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий с NADH на Q-цикл, минуя комплекс I [9, 10]. Ранее мы протестировали селективные ингибиторы различных комплексов дыхательной цепи и показали, что менадион проявляет свои защитные свойства при блокаде только комплекса I (ротеноном или паракватом). В остальных случаях, при блокаде комплекса II 3-нитропропионовой кислотой, комплекса III антимицином и комплекса IV азидом, менадион не влиял на выживаемость нейронов [11] и, следовательно, может служить маркером цитоток-сичности, опосредуемой блокадой комплекса I.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что нейроцитотоксиче-ское действие EIPA может быть опосредовано блокадой комплекса I дыхательной цепи митохондрий. Это подтверждается данными, полученными другой группой исследователей на изолированных митохондриях, показавших, что EIPA способен блокировать перенос протонов комплексом I [12]. Кроме того, гибель КЗН почти полностью предотвращалась антиоксидантом тролоксом, что может указывать на вовлечение в механизмы деструкции нейронов, вызываемой EIPA, процесса перекисного окисления липидов мембран, следствием чего является возрастание утечки протонов у митохондрий [13].
Как было показано нами ранее, менадион и тролокс предотвращают вызванную внеклеточным ацидозом гибель КЗН, что свидетельствует об определенном сходстве механизмов токсического действия EIPA и внеклеточного ацидоза. Однако эти механизмы полностью не идентичны. При ацидозе в них вовлечена дерегуляция содержания ионов цинка в клетке, поскольку специфический хелатор ионов цинка TPEN препятствовал нейрональной гибели, вызванной ацидозом, но не влиял на токсическое действие EIPA. Кроме того, в проведенных нами ранее экспериментах зрелые КЗН (7—8 DIV), повреждавшиеся при токсическом действии глутамата, были устойчивы к внеклеточному ацидозу, тогда как в незрелых культурах (3 DIV) нейроны не реагиро-
156
СТЕЛЬМАШУК и др.
Контроль
Тролокс
Менадион
£ с о
л PQ
100
75
50
25
Рис. 1. Влияние менадиона (0.003 мМ, 24 ч) и антиоксиданта тролокс (0.1 мМ, 24 ч) на выживаемость КЗН при действии EIPA (0.01 мМ, 24 ч) в зрелых культурах (7—8 DIV).
(а) Фиксированные культуры, окрашенные трипановым синим, стрелками указаны ядра погибших нейронов. Масштаб 15 мкм. (б) Данные количественной оценки выживаемости нейронов. + р < 0.001 по сравнению с контролем; * р < 0.001 по сравнению с EIPA.
^ 100
ть
с
о
е а
<ч
и
^
3 PQ
75
50
25
^ 100
ть
с
о
е а
<ч
и
^
3 PQ
75
50
25
а
0
*
0
0
Рис. 2. Хелатор ионов цинка TPEN (0.005 мМ, 24 ч) не оказывает защитного эффекта на выживаемость КЗН при токсическом действии EIPA (0.01 мМ, 24 ч) в зрелых культурах (7—8 DIV).
Рис. 3. Влияние менадиона (0.003 мМ, 24 ч) и антиок-сиданта тролокс (0.1 мМ, 24 ч) на выживаемость КЗН при действии EIPA (0.01 мМ, 24 ч) в незрелых культурах (3 DIV).
+ р < 0.001 по сравнению с контролем; * р < 0.001 при сравнении с EIPA.
МЕХАНИЗМ НЕЙРОЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БЛОКАТОРА
157
вали на глутамат в токсических концентрациях, но при внеклеточном ацидозе погибали [14]. Наряду с этим, Е1РА, в отличие от внешнего ацидоза, для зрелых нейронов был даже более токсичен, чем для незрелых.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исходя из полученных нами данных, можно заключить, что основной причиной гибели культивированных зернистых нейронов мозжечка, вызываемой EIPA, является блокада комплекса I. Кроме того, в механизм нейродеструктивного эффект
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.