БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 1, с. 97-104
УДК 539.193:615.78
МЕХАНИЗМЫ БЛОКАДЫ ИОННЫХ КАНАЛОВ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ: ПАРАДОКС 9-АМИНОАКРИДИНА
© 2007 г. К. X. Ким, В. Е. Гмиро*, Д. Б. Тихонов, Л. Г. Магазаник
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза д. 44; факс: (812) 552-30-12; электронная почта: magazanik@mail.ru * Институт экспериментальной медицины РАМН, 197376 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12
Поступила в редакцию 03.07.2006 г.
Среди блокаторов ионных каналов глутаматных рецепторов №МВЛ-типа 9-аминоакридин и такрин выделяются тем, что их связывание препятствует закрытию блокированного канала и последующей диссоциации агониста. Особенности структуры аминоакридиновых производных, определяющие данный механизм блокады, остаются неизвестными. В данной работе исследовали действие дикатионно-го аналога 9-аминоакридина и ряда других трициклических соединений на ММЛА-рецепторы пирамидных нейронов гиппокампа крысы. Все исследованные соединения являются потенциалозависимы-ми блокаторами КМБА-каналов и при потенциале фиксации -80 мВ имеют величины ИК50 в пределах 1-50 мкМ. Дикатионные производные демонстрируют такую же потенциалозависимость блокады, как и монокатионные. Как моно-, так и дикатионные трициклические соединения являются слабыми блокаторами каналов АМРА-типа. Эти особенности отличают их от производных адаман-тана, фенилциклогексила и др., для которых было показано, что дикатионные производные обладают более выраженной потенциалозависимостью блокады КМБА-канала и эффективно блокируют АМРА-каналы. Трициклические соединения и дикатионные аналоги 9-аминоакридина отличаются от 9-аминоакридина по механизму действия, поскольку не препятствуют закрытию блокированного канала. Сделан вывод о том, что сайт связывания 9-аминоакридина обладает специфическими характеристиками и высокой избирательностью по отношению к структуре лиганда.
Ионотропные рецепторы глутамата состоят из внеклеточного домена, связывающего глутамат или его агонист, и управляемого им ионного канала. Блокада ионных каналов глутаматных рецепторов органическими катионами может иметь важное терапевтическое значение, поскольку единственный используемый в практике препарат антиглутамат-ного действия, мемантин, является именно блока-тором каналов в рецепторах КМБЛ-типа (КМБЛ-каналов). Мемантин не самый сильный блокатор: например, МК801 и фенциклидин обладают более выраженным блокирующим действием. Однако их применение сопровождается тяжелыми побочными эффектами [1, 2]. Очевидно, что для физиологического действия блокаторов важны не только величина блокирующей активности, но и особенности механизма действия. Например, в отличие от МК801, мемантин способен в некоторой степени препятствовать закрытию активационных ворот КМБЛ-канала, проявляя свойства "частичной ловушки" [3]. Детали механизма действия меман-тина на КМБЛ-канал исследовали в работах [4-6].
Различия в проявлении эффекта ловушки являются одним из парадоксов в исследовании блокады КМБЛ-каналов. Такие соединения, как МК801, фенциклидин и кетамин не препятствуют переходу блокированного канала в закрытое состояние, т.е.
эти вещества работают по механизму "полной ловушки" [7]. Напротив, связывание в канале 9-аминоакридина [8] и его тетрагидроаналога [9], а также тетрапентиламмония [10] не позволяет каналу закрыться, так что при действии этих соединений "ловушка" не наблюдается [11]. Многие соединения, как и мемантин, обнаруживают свойства частичной ловушки [12, 13]. С точки зрения принципиальной структуры канала, эффект ловушки объясняется тем, что место связывания блокатора расположено в канале глубже, чем активационные ворота. Блокатор может входить в канал и покидать его только в том случае, если канал открыт. При этом блокатор может оставаться в полости канала при его закрытии. Если же блокатор при связывании взаимодействует с каналом в области ворот, то закрытие канала затруднено или невозможно. Это соответствует отсутствию эффекта ловушки. В работах, посвященных изучению механизма ловушки, обсуждаются две основных гипотезы. Первая состоит в том, что место связывания у всех блокаторов одно, но блокаторы большого размера не могут поместиться в полости закрытого канала и тем самым препятствуют его закрытию. Этой гипотезе противоречит тот факт, что нет строгой корреляции между стерическими размерами блокаторов КМБЛ-каналов и выраженно-
стью эффекта ловушки [13]. Альтернативной является гипотеза о существовании двух сайтов связывания, причем ловушка возможна только при связывании с одним из них. В этом случае выраженность ловушки для определенного блокатора определяется соотношением его сродства к этим сайтам связывания.
Структурные детерминанты связывания блока-торов, демонстрирующих полную или частичную ловушку, хорошо изучены [14]. Наиболее активные соединения имеют V-образную пространственную структуру с гидрофобными или ароматическими "крыльями" и протонируемым азотом в вершине. Соответственно, сайт связывания таких блокаторов должен представлять собой гидрофобную воронку, в устье которой расположен акцептор водородной связи. Наиболее вероятно, что этот сайт расположен на входе в наиболее узкую часть канала, называемую селективным фильтром [15]. В ряду блокаторов NMDA-каналов 9-ами-ноакридин занимает особое место, поскольку он является единственным высокоактивным блока-тором, не проявляющим феномена ловушки. Его плоская трициклическая структура резко отличается от V-образной формы многочисленных "ло-вушковых" блокаторов. Однако структурные характеристики, определяющие механизм действия 9-аминоакридина, остаются неизученными, так что в настоящее время затруднительно судить об особенностях сайта его связывания с каналом.
В данной работе предпринята попытка изучить влияние структурных модификаций в молекуле 9-аминоакридина на его активность и механизм действия. Мы показали, что замена акридиновой группы на другие трициклические структуры не приводит к падению блокирующей активности, но существенно изменяет механизм действия. Дикати-онный аналог также утрачивает характерные для 9-аминоакридина особенности блокады. Сделан вывод о том, что сайт связывания 9-аминоакридина обладает специфическими характеристиками и предъявляет строгие требования к структуре лиганда.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Крыс линии Вистар (возраст 13-18 дней) дека-питировали под уретановым наркозом. Мозг быстро извлекали и охлаждали до 2-4°С. Затем на виб-ратоме "Campden Instruments" (Великобритания) приготавливали поперечные срезы стриатума и гиппокампа толщиной 200-300 мкм, которые сохраняли в растворе (мМ): NaCl - 124, KCl - 5, CaCl2 -1.3, MgCl2 - 2, NaHCO3 - 26, NaH2PO4 - 1.24, D-глюкоза - 10. Раствор аэрировали карбогеном (95% О2, 5% СО2), рН 7.4-7.5, при 24-26°С. Нейроны, экс-прессирующие определенный вид глутаматных рецепторов, изолировали из срезов методом вибродиссоциации [16] спустя не менее 2 ч с момента их приготовления. Для исследования NMDA-каналов
выбирали пирамидные нейроны, выделенные из поля CA1 гиппокампа, а для исследования AMPA-рецепторов - гигантские интернейроны стриатума. Пирамидные нейроны гиппокампа идентифицировали по морфологическим признакам. Наряду с этими признаками при идентификации интернейронов стриатума проверяли их чувствительность к иЭМ-1460, являющимся избирательным блокатором AMPA-каналов, лишенных субъединицы GluR2 [17].
Для регистрации трансмембранных токов применяли метод локальной фиксации потенциала. Микропипетку заполняли раствором (мМ): CsF -100, CsCl - 40, NaCl - 5, CaCl2 - 0.5, EGTA - 5, HEPES - 10 (pH доводили до 7.2 добавлением CsOH). Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl - 143, KCl - 5, CaCl2 - 2.5, D-глюкоза - 18, HEPES - 10 (pH доводили до 7.4 добавлением HCl). При исследовании AMPA-рецепторов во внеклеточный раствор добавляли MgCl2 в концентрации 2 мМ. Рецепторы активировали аппликацией соответствующих агонистов глутамата: NMDA-рецеп-торы - NMDA (30 мкМ) в присутствии глицина (10 мкМ); AMPA-рецепторы - каинатом (100 мкМ). Для аппликации применяли систему быстрой замены растворов [18]. Регистрацию проводили в конфигурации "целая клетка" c помощью усилителя EPC-8 "HEKA Electronik" (Германия). Контроль мембранного потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью компьютера.
Эффективность блокады анализировали путем построения кривых концентрация - действие при потенциале фиксации -80 мВ. Для этого оценивали степень угнетения стационарного тока при действии блокаторов в различных концентрациях. Кривые аппроксимировали в соответствии с формулой (1):
I - од, = 1/(1 + иадва (1)
где I и Iq - токи, вызванные аппликацией агониста в присутствии и в отсутствие блокатора соответственно; [B] - концентрация апплицируемого блокатора, ИК50 - концентрация блокатора, вызывающая 50% угнетение ответов, h - коэффициент Хилла.
Потенциалозависимость блокады определяли с помощью модели [19]. Зависимость блокады токов от потенциала фиксации аппроксимировали уравнением:
I/Iq = 1/(1 + [В]/ИК50(0) X exp{z5FE/RT}), (2)
где E - потенциал фиксации; ИК50(0) - расчетное значение величины ИК50, которая наблюдалась бы при E = 0 мВ; z - заряд молекулы блокатора; 5 -доля падения потенциала в мембране, соответствующая глубине нахождения участка связывания блокатора; F - константа Фарадея; R - газовая постоянная; T - абсолютная температура. Для анали-
N+Нз
9-аминоакридин (9-AA)
N+H2—(CH2)6—N+Me3 ИЭМ-2114
N+H3 N+H2—(CH2)6-N+H3
такрин ИЭМ-2120
N+H2—(CH2)5 —N+Me3 ИЭМ-2117 ИЭМ-2118
ИЭМ-2115 ИЭМ-2116
CH2—N+H3 ИЭМ-2014
N+H^(CH2)^N+H3 ИЭМ-1925
Рис. 1. Структурные формулы соединений, использованных в работе.
за выбирали концентрации блокаторов, составляющие 2-3 ИК50, определенные при потенциале фиксации -80мВ.
Для экспериментов использовали реактивы фирмы "Sigma" (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Активность блокаторов и потенциалозави-симость блокады. Структурные формулы исследованных соединений приведены на рис. 1. Для сопоставления механизмов блокады использовали моно- и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.