УДК 577.151.45
МЕХАНИЗМЫ ДИФФУЗИОННОГО ПОИСКА СПЕЦИФИЧНЫХ МИШЕНЕЙ ДНК-ЗАВИСИМЫМИ БЕЛКАМИ
Обзор
© 2014 Г.В. Мечетин1, Д.О. Жарков12*
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2; факс: (383)363-5153, электронная почта: dzharkov@niboch.nsc.ru
Поступила в редакцию 12.01.14 После доработки 26.02.14
Для осуществления своих функций многие ДНК-зависимые белки должны быстро находить специфичные мишени на фоне огромного избытка неспецифичной ДНК. Несмотря на то, что впервые эта проблема была сформулирована более 40 лет назад, механизм такого поиска остается одной из нерешенных до конца фундаментальных задач в области ДНК-белковых взаимодействий. Предполагается существование нескольких взаимодополняющих способов: механизм «скольжения», при котором поиск идет посредством одномерной диффузии вдоль контура ДНК в случайном направлении, механизм «перепрыгивания» белка между близко расположенными участками цепи ДНК, макроскопическая ассоциация—диссоциация ДНК-белкового комплекса и интерсегментный перенос. В обзоре проанализировано современное состояние проблемы поиска белками мишеней в ДНК, теоретические описания и методы исследования этого процесса на уровне ансамблей молекул (макроскопические методы) и на уровне индивидуальных молекул (микроскопические методы). Практически все исследованные ДНК-зависимые белки ведут поиск специфичных мишеней, сочетая диффузию в трехмерном пространстве и одномерную диффузию по контуру ДНК.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК-белковые взаимодействия, поиск мишеней в ДНК, одномерная диффузия, репарация ДНК, эндонуклеазы рестрикции, факторы транскрипции.
Многие ДНК-связывающие белки обладают высокой аффинностью (Kd = 10-8—10-12 М) к определенным редко встречающимся последовательностям или структурным элементам ДНК («мишеням»), и с гораздо меньшим, но все равно заметным сродством (Kd = 10-4—10-6 М) связывают неспецифичную ДНК. Как правило, в этих случаях образование специфичного комплекса белок—ДНК-мишень происходит без дополнительных затрат энергии (например, энергии гидролиза ATP), и, следовательно, имеет исключительно диффузионный характер. Однако значительный избыток неспецифичной ДНК
Принятые сокращения: АСМ — атомно-силовая микроскопия, ОФМ — одномолекулярная флуоресцентная микроскопия, п.н. — пара нуклеотидов, УФ — ультрафиолетовый свет, GFP — зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein), YFP — желтый флуоресцентный белок (yellow fluorescent protein).
* Адресат для корреспонденции.
над специфичными ДНК-мишенями должен конкурентно связывать белок и таким образом затруднять поиск.
Впервые проблема существования дополнительных механизмов, ускоряющих процесс диффузионного поиска специфичных мишеней была поднята в 1970 г. А. Риггсом [1] после того, как было обнаружено, что константа скорости ассоциации /ас-репрессора (Ьае1) с ДНК, содержащей /ас-оператор, превышает теоретический диффузионный предел для диффузии в трех измерениях на 2—3 порядка. Позже для объяснения этого парадокса активно привлекались модели, основанные на снижении размерности пространства поиска, в которых подразумевается, что диффузия белка хотя бы частично происходит по контуру ДНК, т.е. формально в одномерном пространстве. В связи с этим возникло несколько моделей поиска специфичных мишеней ДНК-связывающими белковыми факторами, впервые обобщенных, теоретически опи-
санных и экспериментально проверенных на модели репрессора LacI в работах О. Берга, Р. Винтера и П. фон Хиппеля [2—4]. Можно выделить четыре возможных взаимодополняющих механизма такого поиска (рис. 1): 1) механизм «скольжения» (англ. sliding): белок некоторое время перемещается по ДНК строго посредством одномерной диффузии в случайном направлении по контуру ДНК, и при этом не происходит распада ДНК-белкового комплекса; 2) механизм «перепрыгивания» (англ. hopping), или микроскопической диссоциации—ассоциации ДНК-белкового комплекса, когда белок перемещается между близко расположенными отрезками контура ДНК, находясь в непосредственной близости от нее; во время «прыжка»
расстояние между поверхностями взаимодействия ДНК и белка увеличивается на несколько молекулярных слоев воды; 3) макроскопическая ассоциация—диссоциация ДНК-белкового комплекса, в результате которой поиск мишени осуществляется строго по механизму трехмерной диффузии: белок связывается с ДНК в произвольной области; если она не оказалась специфичной мишенью, ДНК-белковый комплекс диссоциирует и белок вновь связывается с ДНК в другом месте; 4) интерсегментный перенос молекулы белка между двумя удаленными участками контура ДНК при их сближении в пространстве без высвобождения ДНК. Интерсегментный перенос возможен при наличии в молекуле белка не менее двух идентичных сайтов связы-
а
б
р
Г
щ *
О
Рис. 1. Возможные механизмы диффузионного поиска специфичных мишеней (X) ДНК-зависимыми белками. а — Скольжение; б — перепрыгивание; в — дистрибутивный механизм; г — интерсегментный перенос. Разрыв в цепи ДНК (а—в) схематически обозначает результат действия ДНК-зависимых ферментов; в случае некаталитических белков они остаются связанными с найденным специфичным сайтом
г
вания ДНК, как в случае эндонуклеаз рестрикции или олигомерных транскрипционных факторов.
Способы 1 и 2 объединены под названием коррелированных механизмов поиска, так как положение белка на контуре ДНК в любой момент времени коррелирует с его положением в предыдущий момент времени. Если белок обладает ферментативной активностью (например, эндо-нуклеазы рестрикции, ферменты репарации ДНК), то при связывании со специфичной мишенью он расщепляет ДНК и высвобождает ее; если же не обладает (например, факторы транскрипции), то остается связанным с мишенью. В случае, когда фермент остается связанным с ДНК после каталитического акта расщепления специфичной мишени, говорят о коррелированном расщеплении или процессивности фермента [5]. Важно отметить, что наблюдение коррелированного расщепления означает наличие коррелированного поиска (фермент остался связанным с ДНК на время перемещения между двумя соседними мишенями), в то время как обратное, строго говоря, неверно — если фермент-субстратный комплекс полностью диссоциирует после реакции, то коррелированного расщепления не наблюдается даже при поиске по коррелированному механизму. В противоположность коррелированному поиску, способы 3 и 4 объединены как дистрибутивные механизмы поиска, поскольку положение белка на контуре ДНК в каждый момент времени распределено случайно.
Поскольку связывание большинства белков с неспецифичной ДНК имеет в основном электростатический характер, термодинамическая константа ассоциации ДНК-белкового комплекса уменьшается при увеличении ионной силы среды [4], что ведет к увеличению вклада дистрибутивного механизма вплоть до его полного доминирования при высокой ионной силе [2, 4]. Эта зависимость используется повсеместно для изучения механизмов перемещения ДНК-зависимых белков по ДНК. Механизм 3 с кинетической точки зрения рассматривается как процесс непосредственной одностадийной ассоциации белка со специфичной мишенью, при этом все непродуктивные акты ассоциации снижают ее константу скорости [2]. Механизмы 1 и 2 рассматриваются как процесс ассоциации белка с неспецифичной ДНК с дальнейшим связыванием со специфичной последовательностью. Исходя из этих кинетических схем, были выведены теоретические зависимости кинетических параметров процесса поиска для разных механизмов, оценены их максимальные значения и влияние на них ионной силы [2—4]. В результате экспериментальной проверки т
vitro авторы пришли к выводу, что в физиологических условиях белок LacI ищет lac-оператор со значительным вкладом скольжения и возможным вкладом перепрыгивания. Использование такого механизма увеличивает скорость поиска относительно строго дистрибутивной модели в ~104 раз.
После первоначальных работ [2—4] механизм поиска мишеней был достаточно подробно исследован для трех классов белков: транскрипционных факторов, эндонуклеаз рестрикции и ферментов репарации ДНК. Однако основные выводы, сделанные для этих систем, подтверждаются практически для всех других исследованных ДНК-зависимых белков [5].
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ПОИСКА МИШЕНЕЙ В ДНК
Вероятностное описание диффузии белка по ДНК. С момента появления работ [2—4], где впервые в терминах кинетических констант были теоретически описаны механизмы поиска белками специфичных мишеней в ДНК, был разработан еще ряд теорий, описывающих такой поиск. Значительная их часть пренебрегает физической природой взаимодействующих молекул и формально рассматривает перемещение белка по одномерной решетке как последовательность событий, образующих цепь Маркова. Находясь в /-той позиции решетки, белок может перейти в позицию i + 1 или i — 1 с вероятностью p+ = p_, причем последующее состояние системы не зависит от ее предыдущей истории. Для подобных марковских процессов при равных вероятностях перехода хорошо известно, что в трехмерном случае блуждающий объект удаляется от начальной точки с течением времени, а в одно- и двумерных случаях — нет, что делает строго одномерный коррелированный поиск неэффективным для протяженных последовательностей ДНК [5]. В одномерном случае при равных вероятностях перехода в позиции i + 1 и i — 1 среднее число шагов, необходимое для достижения позиции, отстоящей на N шагов от точки старта, пропорционально N2 [6]. Оценка времени полного осмотра бактериального генома размером 5 х 106 п.н. одной молекулой фермента при константе одномерной диффузии 1 мкм2/с (это значение достаточно высоко; например, для РНК-полимеразы E. coli и рестриктазы EcoRV константы одномерной диффузии имеют порядок 10-2 мкм2/с [7, 8]) составляет ~106 с [9], что слишком долго для внутриклеточных процессов.
Очевидное решение проблемы быстрого поиска состоит в комбинации коррелированного
одномерного поиска с трехмерной диффузией и интерсегментным переносом. Согласно оценкам время, необходимо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.