БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 5, с. 541 - 552
УДК 57.03,577.352.53
МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕРАЦИИ ЛОКАЛЬНОЙ АрН В МИТОХОНДРИЯХ И БАКТЕРИЯХ***
© 2014 Э.С. Медведев1***, А.А. Стучебрюхов2
1 Институт проблем химической физики РАН, 142432 Черноголовка Ногинского района Московской области, просп. Академика Н.Н. Семенова, 1;
факс: (496)522-3507, электронная почта: esmedved@orc.ru
2 Химический факультет Калифорнийского университета, Дэвис, Калифорния, 95616 США; факс: (530)752-8995, электронная почта: stuchebr@chem.ucdavis.edu
Поступила в редакцию 24.11.14 После доработки 08.02.14
В теории окислительного фосфорилирования сосуществуют концепции глобальной и локальной связи между протонными генераторами (ферментами дыхательной цепи) и потребителем (АТФ-синтазой). Глобальная связь — это тривиальный перенос протонов через водную среду, тогда как локальная связь предполагает, что прокачиваемые протоны потребляются до того, как они диссипируют в объем. В данной работе исследованы условия реализации локальной связи. Предполагается, что мембрана задерживает протоны у своей поверхности, и что протонный ток, создаваемый насосами, быстро падает с ростом протондвижущей силы (ПДС). Показано, что конкуренция процессов переноса протонов через мембрану и их диссипации с поверхности в объем может приводить к кратковременной генерации локальной АрН при резком изменении ПДС; возникновение локальной АрН, в свою очередь, приводит к быстрому восстановлению ПДС и, таким образом, способствует стабилизации потенциала на мембране. Рассмотрены два механизма такого типа: 1) изменение рН в приповерхностной области за счет работы насосов происходит быстрее, чем из-за ухода протонов в объем; 2) первое не имеет места, но протоны, покинувшие поверхность, не приходят немедленно в равновесие с объемом, а создают неравновесную концентрацию в приповерхностной области и как результат — обратный поток на поверхность. Первый механизм более эффективен, но он не реализуется в митохондриях и нейтрофильных бактериях, а второй может давать АрН порядка единицы. В отсутствие задержки протонов у поверхности локальная АрН не образуется, а генерация глобальной АрН возможна лишь при концентрации буфера менее 10 мМ. Обсуждается роль предложенных механизмов в переходах между состояниями 3 и 4 дыхательной цепи. Главный вывод состоит в том, что в условиях, когда поверхностные протоны играют роль, они способствуют стабилизации мембранной ПДС и быстрой коммуникации между генераторами и потребителями протонов, в то время как их вклад в энергетику незначителен.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: синтез АТФ, протондвижущая сила, протонный насос, локальная связь, глобальная связь.
Для реакции синтеза АТФ справедливо общее термодинамическое соотношение между скоростями прямой и обратной реакций: отношение этих скоростей, т.е. константа равнове-
Принятые сокращения: ПДС и pmf — протондвижущая сила; ЭП — разность электрических потенциалов на мембране; ХП — разность химических потенциалов по обе стороны мембраны; М — митохондриальная мембрана; В — бактериальная мембрана; 8рНа — локальное изменение рН на данной стороне мембраны по отношению к равновесному — см. формулу (19); АрН„ — трансмембранная локальная разность рН — см. формулу (20).
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-325, 06.04.2014.
** Приложение опубликовано на сайте «Biochemistry» (Moscow), Vol. 79, issue 5, 2014. *** Адресат для корреспонденции.
сия зависит только от разности электрохимических потенциалов Ар^, или протондвижущей силы АДН+/^ (ПДС) на мембране,
ЛцН+ = F Лф +
(1)
Лцн+ = RT In
V л
Ж vV j
:-(ЛГ1п10)ДрН, (2)
и не зависит по отдельности от ее составляющих — разности электрических Аф = ф' — ф" или химических АрН+ потенциалов (ЭП и ХП). Однако каждая из двух скоростей может по-разному зависеть от компонент ПДС, что проявляется в неравновесных условиях, создаваемых работой
+
протонных насосов. Вопрос о фактическом виде этой зависимости остается дискуссионным: одни авторы утверждают, что такой зависимости нет [1, 2], другие же ищут зависимость от ЛрН [3]. Обсуждение этого вопроса выходит за рамки данной работы, в которой мы будем рассматривать проблему генерации Лф и ЛрН протонными насосами в митохондриях и нейтрофильных бактериях.
Вопрос о генерации Лф решается просто. Пусть удельная электрическая емкость мембраны и ее площадь равны СтетЬ и СтетЬ. Тогда перенос одного элементарного заряда е0 через мембрану создает разность потенциалов фе = е0/(СтетЬ 5тетЬ). Для митохондриальной (М) и бактериальной (В) мембран с параметрами из табл. 1 получается, соответственно, фе = 0,25 и 20 мкВ.
Сложнее обстоит дело с генерацией ЛрН. В митохондриях матрикс и межмембранное пространство содержат большие концентрации буфера, который препятствует изменению рН. У бактерий в цитозоле также содержится много буфера, а периплазма сообщается с внешней средой практически бесконечного объема. Р. Вильямс [4—7] выдвинул концепцию локальной связи в теории окислительного фосфорилирования, которая предполагает генерацию локальной ЛрН внутри мембраны или, по версии Д. Келла [8],
на ее поверхности, в отличие от глобальной ЛрН в теории П. Митчелла [9]. В литературе накоплено много экспериментальных данных в пользу локального механизма [10, 15—17]. Теоретически возможность генерации локальных изменений рН на биологических мембранах в отсутствие буфера рассматривалась в работе Черепанова с соавт. [16]. Однако, насколько нам известно, не было представлено теоретического обоснования возможности образования локальных ЛрН на мембранах в буферных средах.
В данной работе мы постулируем формулу, описывающую зависимость протонного тока от ПДС и параметров системы, и на ее основе предлагаем два механизма генерации локальной ЛрН.
Относительно мембраны предполагается, что существует приповерхностная область а шириной в две водородные связи, в которой концентрация протонов существенно повышена по отношению к объемной области Ь вследствие притяжения протонов мембраной. Локальные изменения рН относительно равновесных значений (они обозначаются 8рНа) возникают в областях а по обе стороны мембраны. Упомянутые механизмы состоят в следующем.
1. Благодаря большой плотности ферментов на мембране и малому объему области а ско-
Таблица 1. Параметры модели
Параметр Значение Определение, ссылка
V 1 мкм3 внутренний объем митохондрии и бактерии
1 0,6 нм толщина приповерхностного слоя [18]
и 10ЯГ высота барьера [18]
с ^шешЬ 45/0,8 мкм2 площадь мембраны М/В [24, 31, 32]/[19, 20]
С ^тетЬ 1,5/1,0 мкФ см-2 удельная емкость мембраны М/В [24, 31, 32]/[19, 20, 22, 23, 26, 33-35]
100 нм2 площадь на один насос*
^ритр 103 с-1 частота срабатывания насоса*
9,3 х 10-5 см2 с-1 коэффициент диффузии свободных протонов в периплазме бактерий
Яви 10-7 см2 с-1 коэффициент диффузии связанных протонов в матриксе и межмембранном пространстве митохондрий и в цитозоле бактерий
Св, РКВ 1 мМ, 7 концентрация и рК подвижного буфера в матриксе и межмембранном пространстве митохондрий и в цитозоле бактерий [27]
рИЬ,ед 7 объемное равновесное значение рН с обеих сторон мембран М и В
* В работе Черепанова с соавт. [16] используются значения = 500 нм2 и к,™, = 500 с '.
рость изменения концентрации протонов в этой области за счет работы протонных насосов при малых значениях ПДС может быть чрезвычайно высока, порядка скорости обмена протонов между а и Ь. Тогда |8рНа| растет до максимального уровня, определяемого конкуренцией двух указанных процессов.
2. Если скорость прокачки недостаточно велика, и механизм 1 не работает, генерация 8рНа все еще возможна в силу медленной диффузии протонов в области Ь. Как показано в нашей предыдущей работе [18], быстрый по сравнению с диффузией обмен неравновесных протонов между областями а и Ь приводит к тому, что релаксация протонной концентрации в области а к ее равновесному значению происходит по очень медленному степенному закону, что, в свою очередь, ведет к нарастанию |8рНа|.
Механизмы 1 и 2 могут приводить к значительным, хотя и кратковременным изменениям локальной ЛрН в приповерхностных областях при резком изменении ПДС, если концентрация подвижного буфера не более 1 мМ. В отсутствие поверхностного эффекта изменения объемного рН весьма малы (<0,1) из-за наличия больших концентраций буфера ~100 мМ, но они могут стать существенными при концентрациях менее 10 мМ. Более значительные изменения рН в объеме возникают при включении транспорта других катионов [19, 20].
Предсказываемые механизмы могут быть исследованы методами флуоресцентной корреляционной спектроскопии [21], которые позволяют измерять кинетику процессов протонирования на поверхности биологических мембран в широком диапазоне времен от пикосекунд до секунд.
В разделе 1 вводится модель протонного насоса, в которой предполагается, что скорость прокачки зависит только от ПДС и экспоненциально убывает с ростом ПДС. Расчет показал, что насос прекращает работу, когда ПДС достигает предельного значения, близкого к физиологическому. Этот результат получен без подгонки параметров, что подтверждает правильность модели. Предельное значение ПДС зависит, в основном, от температуры и параметров насоса и слабо - от состава растворов и свойств мембраны. В то же время, деление общей ПДС на две составляющие зависит от состава растворов и свойств мембраны.
В разделе 2 описаны механизмы 1 и 2 и условия их реализации. В разделе 3 приводятся результаты расчетов кинетики генерации ПДС и локальных изменений рН. В разделе 4 обсуждается применение полученных результатов к описанию переходов между состояниями 3 и 4 дыхательной цепи [22, 23].
1. МОДЕЛЬ ПРОТОННОГО НАСОСА
Пусть на мембране площадью стетЬ имеется Нритр = СтетЬ/С1 насосов, имеющих удельную площадь с1 на один насос, которые прокачивают за один цикл 1ритр единиц положительного заряда. Например, цитохром-с-оксидаза потребляет в одном цикле четыре протона с отрицательной (^ стороны мембраны и четыре электрона с положительной (Р) стороны, которые встречаются в каталитическом центре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.