научная статья по теме МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ИЗОБОРНИЛФЕНОЛОВ – НОВОГО КЛАССА АНТИОКСИДАНТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ИЗОБОРНИЛФЕНОЛОВ – НОВОГО КЛАССА АНТИОКСИДАНТОВ»

УДК 612.11:612.118.221.3:577.352.38

МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ИЗОБОРНИЛФЕНОЛОВ -НОВОГО КЛАССА АНТИОКСИДАНТОВ

© 2013 г. О. Г. Шевченко1*, С. Н. Плюснина1, Л. Н. Шишкина2, И. Ю. Чукичева3, И. В. Федорова3, А. В. Кучин3

Институт биологии Коми НЦУрО РАН, 167982, Республика Коми, Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28;

*электронная почта: microtus69@mail.ru 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4 3Институт химии Коми НЦ УрО РАН, 167982, Республика Коми, Сыктывкар, ул. Первомайская, 48

Поступила в редакцию 21.03.2012 г.

Изучены мембранотропные и мембранопротекторные свойства, а также антиоксидантная активность ряда новых полусинтетических антиоксидантов — изоборнилфенолов (терпенофенолов). О цитотоксических и мембранопротекторных свойствах соединений судили по степени спонтанного и индуцированного пероксидом водорода гемолиза эритроцитов. Показано, что все рассмотренные соединения при определенных условиях могут проявлять выраженную антиоксидантную активность, тогда как способность защищать мембрану эритроцитов от окислительного стресса существенно зависит от структуры соединения и его концентрации. Наибольшую мембранопротектор-ную активность проявил 2,6-диизоборнил-4-метилфенол, имеющий изоборнильные заместители в обоих орто-положениях. Изучение поверхностной архитектоники эритроцитов методом сканирующей электронной микроскопии подтвердило способность данных соединений взаимодействовать с мембраной и изменять ее структурное состояние. Выявлена взаимосвязь между характером морфологической трансформации эритроцитов, связанным, в соответствии с гипотезой сопряженного бислоя, с особенностями распределения соединений в плазматической мембране, и цитотоксично-стью высоких концентраций ряда изоборнилфенолов, обусловливающей их низкую мембранопро-текторную активность в модельной клеточной системе. Сделан вывод, что биологическая активность изоборнилфенолов обусловлена как их антиоксидантными свойствами, так и способностью взаимодействовать с мембраной.

Ключевые слова: мембрана эритроцита, гемолиз, перекисное окисление липидов, изоборнилфенолы.

DOI: 10.7868/S0233475512060060

Интенсификация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), протекающих в биомембранах, рассматривается как ключевое звено в развитии самых разнообразных патологий. В связи с этим синтез новых, обладающих антиок-сидантными свойствами, биологически активных веществ (БАВ) на основе природных соединений, безусловно, актуален, поскольку эти соединения, как правило, менее токсичны, чем синтетические препараты [1, 2]. В частности, в опытах in vivo и in vitro показано, что широко применяемый синтетический антиоксидант (АО) 4-метил-2,6-ди-трет-бутилфенол (ионол) в высоких концентрациях может проявлять токсическое действие [3—5]. Биологическая активность большинства БАВ обусловлена их способностью не только влиять на регуляцию процессов ПОЛ, но и воздействовать на структурное состояние клеточных мембран [5, 6], причем исходное состояние мембран существенно влияет на эффективность самих АО [7, 8]. Сле-

довательно, чтобы правильно оценить эффективность АО, необходимо использовать не только химические тесты, но и клеточные модели [9, 10].

Перспективными АО могут быть терпенофенолы (ТФ), синтезированные на основе природных монотерпенов и содержащие в качестве алкильных заместителей изоборнильную группировку — изоборнилфенолы [11]. Высокая антирадикальная и анти-оксидантная активность отдельных ТФ, показанная в химических модельных системах [12] и в опытах на животных [13—15], обусловливает необходимость дальнейшего изучения механизмов действия соединений данного класса на биологических моделях.

Удобным объектом для изучения мембрано-тропной и мембранопротекторной активности различных соединений in vitro являются эритроциты крови млекопитающих [16—24]. Как правило, в целях тестирования антиоксидантной активности и скрининга эффективных мембрано-

протекторов определяют гемолиз эритроцитов в условиях окислительного стресса, индуцируемого различными химическими соединениями, в частности, пероксидом водорода, 2,2-азобис-[амидинопропан]дигидрохлоридом (ААРН), третбутилгидропероксидом и др. [23—28]. Перок-сид водорода — гидропероксид, который вследствие дисмутации O- постоянно образуется в различных органах и клетках, включая эритроциты [29, 30], тогда как прочие индукторы окислительного гемолиза образуют радикалы, которые не существуют в клетке и являются лишь химическими аналогами радикалов биомолекул. Как известно, пероксид водорода легко проникает в эритроциты [30] и взаимодействует с гемоглобином (oxyHb), который окисляется до метгемоглобина (metHb), а затем и до ferrylHb (globin-Fe(IV)=O) [25, 29, 31]. Соотношение между этими продуктами окисления зависит от условий проведения реакции и концентрации пероксида водорода [25, 26, 30— 32]. Вследствие воздействия радикалов на мембранные липиды образуются пероксидные радикалы, которые "запускают" окислительные реакции в мембранах. Усиление ПОЛ — одно из основных последствий окислительных повреждений эритроцитов и, по-видимому, основной механизм их гибели (т.е. гемолиза) [33, 34]. Таким образом, повреждение эритроцитов при окислительном стрессе обусловлено действием преимущественно двух процессов — окисления гемоглобина и сво-боднорадикального повреждения полиненасыщенных жирных кислот мембранных липидов, а также тиоловых групп мембранных белков [7, 32].

Форма эритроцитов и ее изменения служат важным показателем функционального состояния этих клеток в норме и при воздействии различных факторов [35—39]. По структуре поверхности эритроциты здорового организма представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состав которой может динамически изменяться под воздействием физиологических и патологических факторов. Известно, что морфологические изменения наблюдаются не только у циркулирующих в крови эритроцитов, но и в условиях in vitro при взаимодействии эритроцитов с различными химическими соединениями. Снижение количества дискоцитов (клеток, имеющих форму двояковогнутых дисков), увеличение доли аномальных и дегенеративных форм могут вызывать как токсические соединения [35, 40—42], так и биологически активные вещества, способные взаимодействовать с мембранными структурами [19, 36, 43—48]. Известно, что встраивание экзогенных веществ в клеточную мембрану эритроцитов может сопровождаться изменением их формы, причем характер этих изменений указывает на особенности распределения соединения во внутримембранном пространстве. Считается [49], что соединения, приводящие к образованию

эхиноцитов (эритроциты с множественными ши-повидными выростами), встраиваются во внешний монослой эритроцитарной мембраны, вызывая непропорциональное увеличение его площади. При проникновении вещества во внутренний монослой его площадь увеличивается, что приводит в конечном итоге к формированию стомато-цитов (эритроциты чашевидной формы). Таким образом, ценную информацию об особенностях взаимодействия органических неэлектролитов с эритроцитарной мембраной и их распределении в ней можно получить методом сканирующей электронной микроскопии [47—49].

Цель представленной работы состояла в изучении мембранопротекторных и антиоксидантных свойств изоборнилфенолов различной структуры, а также особенностей взаимодействия изо-борнилфенолов с мембраной эритроцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе исследовали изоборнилфенолы, отличающиеся химической структурой и положением заместителей в фенольном кольце: 2-(1,7,7-три-метилбицикло[2,2,1]гепт-экзо-2-ил)оксифенол (I); 4-метил-2-(1,7,7-триметилбицикло[2,2,1]гепт-экзо-2-ил)фенол (II); 2-(1,7,7-триметилбицикло-[2,2,1]гепт-экзо-2-ил)фенол (III); 4-метил-2,6-ди-(1,7,7-триметилбицикло[2,2,1]гепт-экзо-2-ил)фе-нол (IV); 6-метил-2-(1,7,7-триметилбицикло-[2,2,1]гепт-экзо-2-ил)фенол (V). Эти соединения получены по известной методике алкилирования фенолов природным ненасыщенным монотерпеном — камфеном с использованием в качестве катализатора соответствующего фенолята алюминия [11, 50, 51]. Структурные формулы соединений приведены на рис. 1. В качестве эталона сравнения использовали стандартный АО — 4-ме-тил-2,6-ди-трет-бутилфенол (ионол), близкий по структуре пространственно затрудненный фенол, обладающий выраженной антирадикальной активностью, что принято при проведении подобных исследований [1, 16, 19, 25, 52—55].

Способность изоборнилфенолов и ионола непосредственно взаимодействовать с пероксидом водорода и уменьшать его концентрацию проверяли, определяя изменения концентрации пероксида водорода после внесения в среду, содержащую этанольный раствор исследуемых соединений. Концентрацию пероксида водорода определяли спектрофотометрически по образованию окрашенного комплекса с молибдатом аммония при X = 410 нм [56] на спектрофотометре Genesys 20 (ТЬегшоВрее^оше, США).

Для изучения цитотоксических, мембрано-протекторных, антиоксидантных и мембрано-тропных свойств ТФ использовали эритроциты крови самцов белых нелинейных мышей в воз-

HO

III

IV V

Рис. 1. Структурные формулы изоборнилфенолов.

расте 2—3 мес, массой 22—29 г. После декапитации животных кровь собирали в пробирки, обработанные раствором цитрата натрия (5%). Эритроциты отделяли от плазмы и других форменных элементов крови центрифугированием в течение

5 мин (1600 g) и дважды промывали фосфатно-со-левым буфером (PBS: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl 8.1 мМ Na2HPO4, 1.9 мМ NaH2PO4), рН 7.4. Для каждой серии опытов объединяли эритроцитар-ную массу от 5—9 животных. Использовали 1% (v/v) суспензию эритроцитов в PBS (концентрацию определяли по гематокриту). Поскольку и изо-борнилфенолы, и ионол являются гидрофобными соединениями, все АО вводили в суспензию эритроцитов в растворе 96% этанола, концентрация которого в среде инкубации во всех опытах составляла 0.1%. Использование этанола в концентрации менее 1% в качестве растворителя обычно применяется в исследованиях такого рода [24].

Для оценки цитотоксических свойств ТФ растворы исследуемых веществ в концентрации 0.1 М вносили в суспензию эритроцитов в соотношении 1 : 1000 и

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком