ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 458, № 1, с. 102-105
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15;612.017;577.23
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У КРЫС, ИММУНИЗИРОВАННЫХ БСА-КОНЪЮГАТОМ ПЕПТИДА, ПРОИЗВОДНОГО ^КОНЦЕВОГО УЧАСТКА МЕЛАНОКОРТИНОВОГО РЕЦЕПТОРА 4-го ТИПА © 2014 г. К. В. Деркач, Е. А. Шпакова, О. А. Жарова, А. О. Шпаков
Представлено академиком Н.П. Весёлкиным 01.04.2014 г. Поступило 16.04.2014 г.
Б01: 10.7868/80869565214250240
Для изучения этиологии и патогенеза заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, необходимы их экспериментальные модели. Одним из перспективных подходов для их создания является индукция изменений в гормональных сигнальных системах мозга и периферических тканей, ответственных за регуляцию и контроль метаболических процессов. Установлено, что нарушения функциональной активности мелано-кортиновых рецепторов 4-го типа (М4Р) в мозге приводят к изменению пищевого поведения, ожирению, метаболическим расстройствам, в основе чего лежат М4Р-зависимые центральные механизмы [1, 2]. Эти нарушения могут быть вызваны инактивирующими мутациями в М4Р, длительной обработкой синтетическими антагонистами М4Р или повышенной продукцией агути-подобного пептида, эндогенного антагониста М4Р [3, 4].
В настоящем исследовании для моделирования и изучения метаболических нарушений, вызываемых ингибированием М4Р, была разработана стратегия многократной иммунизации экспериментальных животных (крыс) синтетическим пептидом, который соответствует внеклеточному участку М4Р, ответственному за узнавание и связывание М4Р-агонистов. Отправной точкой для разработки такой стратегии явились данные о том, что антитела, продуцируемые против внеклеточных участков других рецепторов серпантинного типа, специфично блокируют связывание с ними агонистов и выключают рецепторы из
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург Институт высокомолекулярных соединений Российской Академии наук, Санкт-Петербург ООО "Teva", Ярославль
сигнальной трансдукции, что приводит к развитию аутоиммунных заболеваний [5—7]. Для иммунизации был использован синтезированный нами ранее пептид К-[Т8ЬНЕ*ЛМЯ88Н0ЬН011-25]-А-амид (К-[11-25]-А), который структурно соответствует внеклеточному М-концевому участку М4Р крысы. Для повышения эффективности иммунизации пептид присоединяли к бычьему сывороточному альбумину (БСА) [8, 9].
Цель работы состояла в изучении влияния длительной иммунизации самцов крыс БСА-конъюгатом пептида К-[11-25]-А на вес тела, метаболические показатели (уровень глюкозы и инсулина, толерантность к глюкозе, липидный статус), а также на содержание тиреоидных гормонов, регулирующих метаболические процессы в ЦНС и периферических тканях. Иммунизацию начинали в полуторамесячном возрасте и проводили многократно в течение года.
Пептид К-[11-25]-А синтезировали с помощью твердофазного синтеза на пара-метилбензгидрил-аминной смоле (емкость 1.16 ммоль/г) с использованием защищенных ^а-трет-бутилоксикарбо-нильными группами аминокислот, как описано ранее [10]. Для образования пептидной связи использовали 1-оксибензотриазолиловые эфиры аминокислот, которые получали с помощью NN диизопропилкарбодиимида. Конъюгат пептида К-[11-25]-А с БСА получали конденсацией с глу-таровым альдегидом. Для этого 30-кратный молярный избыток пептида добавляли к 0.15 мкмоль БСА в 1 мл 0.1 М калий-фосфатного буфера (рН 8.0). К полученному раствору добавляли по каплям в течение 1 ч при комнатной температуре и при перемешивании 300 мкл 21 мМ раствора глутарового альдегида. Через 3 ч перемешивания при комнатной температуре конъюгат очищали с помощью гель-проникающей хроматографии на колонке с сорбентом 8ерИаёех С-75 и лиофили-зовали.
Вес, г
Дни
Рис. 1. Изменение веса тела иммунизированных
крыс на протяжении эксперимента; здесь и на рис. 2:
1 — контроль (n = 6), 2 — иммунизированные крысы
(n = = 6); * p < 0.05 по сравнению с контролем.
Для исследования были взяты полуторамесячные самцы крыс Wistar, которых разделили на две группы — контроль (группа "К", n = 6) и животные, которых иммунизировали БСА-конъюгатом пептида K-[11-25]-A (группа "ИКП", n = 9). Все животные находились на стандартном рационе. Схема иммунизации включала 8 обработок БСА-конъюгатом (внутрибрюшинные инъекции), которые проводили в 1, 30, 60, 90, 190, 300, 320 и 360-й дни эксперимента. Первую иммунизацию осуществляли введением раствора БСА-конъюга-та в полном адъюванте Фрейнда, вторую и третью — введением БСА-конъюгата в неполном адъюванте (в соотношении 1 : 1, объем 400 мкл), все последующие иммунизации проводили сходным образом, но без адъюванта. Дозы БСА-конъ-югата составили при первом и втором введении 20 мкг, при третьем — 40 мкг, в дальнейшем — по 50 мкг на крысу. Группе "К" вместо конъюгата вводили физиологический раствор, причем в случае первых трех инъекций использовали физиологический раствор в смеси с полным или неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1 : 1, объем 400 мкл), в дальнейшем — только физиологический раствор. Для оценки иммунного ответа применяли метод непрямого иммуноферментного анализа на платах с иммобилизованным на них пептидом K-[11-25]-A. Сорбцию гидрофильного поликатионного пептида K-[11-25]-A проводили на иммунобиологическом пластике Nunc MaxiSorp ("Thermo Fisher Scientific, Inc.", Дания), оптимизированном для посадки гидрофильных молекул, в соответствии с рекомендациями фирмы "Nalge Nunc International" (Дания). Посадку на плату проводили в 0.1 М калий-фосфатном буфере (pH 7.3) с учетом изоэлектрической точки
Мин
Мин
Рис. 2. Концентрация глюкозы (а) и инсулина (б) в плазме крови крыс после глюкозной нагрузки (2 г/кг).
пептида (pI = 11.4), которую определяли по алгоритму Kozlowski (http://isoelectric.ovh.org).
Уровень глюкозы в крови крыс измеряли с помощью тест-полосок One Touch Ultra (США) и глюкометра фирмы "Life Scan Johnson & Johnson" (Дания), уровень инсулина — с помощью набора Rat Insulin ELISA ("Mercodia AB", Швеция), уровни свободного (fT4) и общего (tT4) тироксина и общего трийодтиронина (tT3) — с помощью наборов фирмы "НВО Иммунотех" (Россия), уровни триглицеридов, общего и связанного с липо-протеидами холестерина — с помощью наборов фирмы "Ольвекс Диагностикум" (Россия). Статистический анализ данных проводили с использованием программы ANOVA. Данные представлены в виде M ± SD из трех независимых экспери-
104
ДЕРКАЧ и др.
Таблица 1. Метаболические показатели и уровень ти-реоидных гормонов у контрольных и иммунизированных БСА-конъюгатом пептида К-[11-25]-А крыс
Показатель "К" (п = 6) "ИКП" (п = 6)
Глюкоза, ммоль/л 4.1 ± 0.2 5.5 ± 0.4*
Инсулин, мкЕД/мл 5.7 ± 0.3 8.0 ± 0.4*
НОМА-Ж# 1.04 1.96
Триглицериды, ммоль/л 0.85 ± 0.28 1.23 ± 0.29
Общий холестерин, ммоль/л 4.49 ± 0.36 5.93 ± 0.43*
ЛПНП, ммоль/л 1.42 ± 0.23 2.44 ± 0.39*
ЛПВП, ммоль/л 2.89 ± 0.31 2.72 ± 0.18
ЛПОНП, ммоль/л 0.18 ± 0.06 0.77 ± 0.13*
Соотношение ЛПНП/ЛПВП 0.491 0.897
Индекс атерогенности## 0.554 1.180
1Т4, пмоль/л 26.3 ± 4.8 21.2 ± 2.4
1Т4, нмоль/л 78.6 ± 4.3 72.2 ± 5.2
ЛТз, нмоль/л 2.7 ± 0.2 2.0 ± 0.1*
# — индекс инсулиновой резистентности (НОМА-Ш) рассчитывали по формуле [глюкоза, натощак, ммоль/л] ■ [инсулин, натощак, мкЕд/мл]/22.5; ## — индекс атерогенности рассчитывали по формуле [общий холестерин, моль/л]/[ЛПВП-хо-лестерин, моль/л] — 1; * р < 0.05 по сравнению с контрольной группой.
ментов. Различия между пробами оценивали как достоверные прир < 0.05.
Полуколичественная оценка титра антител к БСА-конъюгату пептида, проведенная после последней иммунизации, показала, что у всех девяти крыс группы ИКП имелись антитела к пептиду, но индексы позитивности (отношение к пороговому значению) различались. У шести крыс они были высокими (+++, > 10), у двух — средними (++, 5—10), у одной — низкими (+, 1—5). В дальнейшем изучали крыс с высоким индексом позитивности (п = 6). Выработанные антитела, как мы полагаем, связываются с гомологичным пептиду участком 11—25 М4Р, действуя, как специфичные антагонисты этого рецептора. На это указывает выявленное нами ранее снижение активации адени-латциклазы в синаптосомальных мембранах М4Р-агонистами в присутствии пептида К-[11-25]-А [10]. Следует отметить, что с тем же участком связывается агути-подобный пептид, эндогенный М4Р-антагонист, что приводит к блокированию активности М4Р-зависимых сигнальных путей в ЦНС [11].
У иммунизированных животных на всем протяжении эксперимента вес тела превышал таковой в группе "К" (рис. 1). Уровень тощаковой глюкозы в группе "ИКП" был выше, чем в группе "К". Наряду с этим у иммунизированных животных была нарушена толерантность к глюкозе, о
чем свидетельствуют результаты теста с глюкоз-ной нагрузкой. Через 2 ч после введения глюкозы (внутрибрюшинно, 2 г/кг) ее концентрация у крыс группы "ИКП" была существенно выше, чем в контроле (рис. 2а). Более того, как базовый уровень инсулина (натощак), так и уровень гормона, повышенный в ответ на глюкозную нагрузку, в группе "ИКП" были достоверно выше в сравнении с группой "К" (рис. 2б). Индекс инсу-линовой резистентности (НОМА-1Я) в группе "ИКП" был повышен на 88%. Полученные данные указывают на развитие у иммунизированных животных инсулиновой резистентности.
В группе "ИКП" были выявлены нарушения липидного обмена. Концентрации триглицери-дов, общего холестерина и холестерина липопро-теидов низкой плотности (ЛПНП) были повышены на 45, 32 и 72%, соотношение ЛПНП к липопро-теидам высокой плотности (ЛПВП) и индекс атерогенности увеличивались на 83 и 113%, уровень атерогенных липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) был повышен в 4 раза (табл. 1). Таким образом, иммунизация крыс БСА-конъюгатом пептида К-[11-25]-А приводила к повышению веса, снижению чувствительности тканей к инсулину и дислипидемии, являющихся характерными признаками метаболического синдрома.
Поскольку одним из важнейших регуляторов ростовых и метаболических процессов в организме является тиреоидная система, было проведено исследование ее функционального состояния с помощью определения уровня тиреоидных гормонов. В гр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.