ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2004, № 10, с. 1211-1219
УДК 631.427.22:579.262
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА В Л1-Ре-ГУМУСОВОМ ПОДЗОЛЕ*
© 2004 г. Н. Б. Наумова1, М. Рутгерс2, Г. Н. Копцик3, Н. В. Лукина4, Е. Ю. Милановский3, Т. Н. Пампура5
1Институт почвоведения и агрохимии СО РАН, 630099 г. Новосибирск, ул. Советская, 18 2Институт здоровья населения и окружающей среды, Билтховен, Нидерланды 3Факулътет почвоведения, МГУ им. Ломоносова, 119992 Москва, Ленинские горы 4Институт проблем промышленной экологии Севера, 184200, г. Апатиты, ул. Ферсмана, 19 5Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, д. 2 Поступила в редакцию 11.03.2003 г.
С помощью методов мультисубстратного тестирования и флуоресцентной микроскопии показано, что бактериальные сообщества генетических горизонтов ненарушенного подзола различаются как количественно (по биомассе и численности), так и качественно (по морфологии жизнеспособных клеток и окислению углеводов, ксикарбоновых кислот и фенольных производных).
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время большое внимание уделяется вопросам изучения биологического разнообразия микробных сообществ различных природных экосистем. Наряду с этим все более актуальным становится детальное изучение метаболического разнообразия микробных сообществ как с фундаментальной точки зрения, поскольку оно позволит выявить роль микробного сообщества в функционировании экосистемы [5], так и с прикладной, так как микроорганизмы первыми реагируют на изменение физико-химических свойств окружающей среды [29]. Поскольку микроорганизмы находятся в основании гетеротрофных пищевых цепей и являются важными компонентами экологических сетей, изменения в микробных сообществах могут предвещать изменения состояния среды и жизнеспособности популяций [8].
Практически все знания о метаболическом разнообразии почвенных бактерий - гетеротро-фов и его изменении под воздействием внешних факторов до недавнего времени получали с применением небольшого набора, как правило, резко контрастных по физико-химическим свойствам субстратов (глюкоза-растительное вещество). Известно, однако, что метаболические возможности прокариотов исключительно разнообразны, при этом специализированные виды или консорциумы из ограниченного числа видов существуют как для самых универсальных [16], так и, наоборот, синтетических субстратов [15]. В целом же,
*
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ
(грант < 02-04-48396) и фонда ИНТАС (грант < 2213).
несмотря на всплеск интереса к подобным исследованиям, можно с большим основанием говорить о том, что метаболические спектры различных сообществ микроорганизмов практически мало изучены. Еще меньше известно об их изменении под влиянием различных экологических факторов. Разработка и применение метода мультисубстратного тестирования бактериальных сообществ, выделенных из различных местообитаний [1, 18], позволили начать детализировать метаболический профиль бактериальных сообществ [12], его изменение под влиянием внешних факторов [14, 20, 24], а также его применение для экотоксикологических исследований [23, 28] и для оценки экологических рисков [17, 26].
Различные генетические горизонты почвенного профиля часто, как, например, в подзолах, весьма контрастны по физико-химическим свойствам. Однако, как совершенно справедливо замечено Семионовой с соавт. [4], почвенно-генети-ческим аспектам в микробиологических исследованиях традиционно уделяется мало внимания, особенно за рубежом. Даже если имеются количественные характеристики биоразнообразия микробных сообществ в почве различных генетических горизонтов, то их метаболические спектры практически не изучены. Соответственно, недостаточно изученной является взаимосвязь биогеохимической деятельности микроорганизмов с определенными почвенными процессами.
Известно, что качество и количество органического вещества очень резко меняется по профилю подзолов [2], в частности, возрастает роль фульфокислот в формировании гумуса и относительная роль гидроксикарбоновых кислот и их
ароматических производных. Соответственно должен меняться и фонд доступных для микроорганизмов органических субстратов, и метаболический профиль и биологическое разнообразие микробного сообщества.
Целью нашей работы было сравнительное изучение метаболических спектров бактериальных сообществ различных генетических горизонтов ненарушенного Al-Fe-гумусового подзола методом мультисубстратного тестирования, а также численности и биомассы сообществ с помощью метода прямого микроскопирования.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования послужили Al-Fe-гу-мусовые подзолы ельника кустарничково-зеле-номошного на Кольском полуострове, расположенного на территории, не подверженной влиянию воздушного промышленного загрязнения [2]. Образцы почвы для анализа были отобраны из различных генетических горизонтов - органогенного (О), элювиального (Е) и иллювиально-гумусов железистого (Bhfa). Содержание органического углерода в почве горизонтов О, Е и Bhfa составило 40.0, 0.9 и 2.1%, а соответствующее значение pH водного 4.3, 4.0 и 4.5. Отбор проводили в трех индивидуальных повторностях из каждого горизонта. Почву просеивали через сито с диаметром ячеек 3 мм и хранили при температуре +10°C в течение 4 недель до начала анализа.
Для проведения анализа метаболического разнообразия бактериального сообщества [18] навеску почвы суспендировали в стерильном фосфатном буфере (в соотношении 1 г сухой почвы в 10 мл) при помощи блендера в течение 1 мин на скорости 20 тысяч оборотов в минуту. Полученную суспензию центрифугировали в течение 20 мин при 5 g для того, чтобы избавиться от грибного мицелия, органических и минеральных частиц. После этого готовили 12 последовательных разведений полученного супернатанта (в 3 раза). Для того чтобы иметь возможность сравнить метаболические профили различных сообществ при эквивалентном количестве жизнеспособных клеток, подсчитанных микроскопически в препаратах той же отцентрифугированной суспензии, готовили серию из 12 разведений. Каждым из полученных разведений (в количестве 0.1 мл) ин окулировали 31 ячейку с различными углеродными субстратами и одну контрольную ячейку без углеродного субстрата мультисубст-ратных планшетов (Biolog Inc., Hayward CA, USA). Если бактерии утилизируют источник углерода, они дышат, что приводит к восстановлению находящейся в ячейке соли тетразолия и развитию фиолетовой окраски. Оптическую плотность при 590 нм измеряли 3 раза в день в течение недели с помощью планшетного фотометра [19].
Таким образом для каждого разведения каждого образца и для каждого субстрата получали кривую нарастания оптической плотности в ходе инкубации. Затем рассчитывали площадь под этой кривой, и использовали полученное значение в качестве интегрального показателя окисления того или иного субстрата бактериями в определенной концентрации.
Биомассу почвенных бактерий определяли методом прямого микроскопирования по Блуму [10]. Для этого аликвоту неразведенного супернатанта фиксировали формальдегидом в соотношении 9 : 1. Перед приготовлением препаратов для микроскопирования осевшую почву ресуспенди-ровали, давали отстояться 2 мин и отбирали аликвоту, которую помещали на круглое неокрашенное поле (1 см2) на предметном стекле и равномерно распределяли по нему. После высушивания препараты окрашивали раствором 5-(4,6-дихлор-триазин-2-ил) аминофлуоресцеина в хлоридно-фосфатном буфере с pH 8.5 в течение получаса в темноте, а затем промывали три раза таким же буфером и один раз - водой. Препараты снова высушивали (в темноте), укрепляли герметическим образом покровные стекла и хранили в холодильнике при +2°C до микроскопирования. Прямой подсчет бактерий проводили при микроскопиро-вании препаратов с помощью конфокального лазерного микроскопа с автоматической системой анализа изображения (Quanmet 570, Leica, Cambridge, UK). Биомассу бактерий рассчитывали путем умножения объема на специфическое содержание углерода в бактериальных клетках 3.1 х 10-13 г С мкм-3.
Статистическую обработку данных, полученных с помощью микроскопирования, проводили по /"-критерию Стьюдента. Статистическую обработку данных по динамике окисления различных субстратов проводили методом анализа главных компонент с помощью пакета Statistica v.5.5.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Различные генетические горизонты изученного ненарушенного подзола существенно различаются по содержанию бактерий: содержание бактериальных клеток в почве органогенного горизонта в 10-20 раз превышало таковое в почве нижележащих горизонтов (таблица). По биомассе бактерий различие было несколько менее выражено (в 7-12 раз) из-за большего объема клеток в почве нижних горизонтов (таблица). В почве элювиального горизонта бактерии были более округлыми, чем в почве остальных горизонтов. Очень выражено было различие между горизонтами по количеству колоний, выявляемых в чашках Петри: почва органогенного горизонта содержала в тысячи раз больше колониеобразующих
Некоторые характеристики бактериальных сообществ почвы различных генетических горизонтов
Показатель Горизонт
органический (О) элювиальный (Е) иллювиальный (В)
Число клеток, млрд./г почвы 1.94 ± 0.09 b* 0.1 ± 0.02 a 0.2 ± 0.02 a
Биомасса, мкг С/г почвы 95 ± 4 b 8 ± 1 a 13 ± 4 a
Средний объем клетки, мкм3 0.153 ± 0.02 a 0.266 ± 0.03 b 0.214 ± 0.05 ab
Отношение длины к ширине 1.45 ± 0.04 b 1.29 ± 0.03 a 1.45 ± 0.07 ab
Частота делящихся клеток 1.47 ± 0.83 a 2.02 ± 1.21 a 1.61 ± 0.22 a
Число КОЕ, млн./г почвы 325 ± 47 c 0.06 ± 0.01 a 0.17 ± 0.03 b
Отношение КОЕ к числу клеток, % 17 ± 3 b 0.1 ± 0.02 a 0.1 ± 0.04 a
* Числа в строках таблицы, отмеченные разными буквами, различаются достоверно на уровне значимости Р < 0.05.
единиц, чем почвы минеральных горизонтов (таблица). Таким образом, как количественно, так и физиономически, то есть по форме и объему клеток, выявлена значительная разница между бактериальными сообществами различных генетических горизонтов ненарушенного Al-Fe-гу-мусового подзола. При этом наиболее резко по всем пока
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.