УДК 577.128.084.1;549.731.13-022.532;615.015.42
МЕТАБОЛИЗМ ЖЕЛЕЗА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ КРЫСАМ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ МАГНЕТИТА
© 2014 И.В. Мильто12*, А.Ю. Гришанова3, Т.К. Климентьева1, И.В. Суходоло1, Г.Ю. Васюков1, В.В. Иванова1
1 Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России, 634050 Томск, Московский тракт, 2; факс: (3822)53-3309, электронная почта: office@ssmu.ru 2 Национальный исследовательский Томский политехнический университет, 634050 Томск, пр. Ленина, 36; факс: (3822)56-3865, электронная почта: tpu@tpu.ru
3 Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, 630117 Новосибирск, ул. Тимакова, 2/12; факс: (383)335-9847, электронная почта: imbb@soramn.ru, milto_bio@mail.ru
Поступила в редакцию 03.03.14 После доработки 12.05.14
В работе изучается влияние модифицированных наноразмерных частиц магнетита — НЧМ (магнитных микросфер, покрытых хитозаном и магнитолипосом) после однократного внутривенного введения их суспензий на обмен железа в организме крыс. Современными физико-химическими методами (рентгено-флу-оресцентный, динамического светорассеяния, трансмиссионная электронная микроскопия) проведена стандартизация модифицированных НЧМ (определены размер, форма, ^-потенциал и концентрация частиц). Методом атомно-эмиссионной спектроскопии показана динамика содержания железа в печени, селезенке, легких и почках крыс в течение 120 сут. Колориметрическими и иммунотурбидиметрическими методами определены концентрации плазменного железа, а также белков, участвующих в его обмене (церуло-плазмина, трансферрина и ферритина), показана их динамика на протяжении эксперимента.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: наночастицы магнетита, магнитолипосомы, модифицированный хитозаном нано-магнетит, трансферрин, церулоплазмин, ферритин.
Несмотря на успешное экспериментальное изучение наноматериалов, многие принципиально важные вопросы относительно механизмов их взаимодействия с биомолекулами и клетками остаются неясными. Так, например, отсутствует четкое представление о способах проникновения наноматериалов в клетки, недостаточно изучен механизм их повреждающего действия. Большинство авторов связывают токсические эффекты НЧМ с инициацией свободнорадикаль-ных процессов в клетке и накоплением продуктов перекисного окисления биологических соединений [1—3]. Высокая степень дисперсности и, как следствие, развитая удельная поверхность НЧМ приводят к тому, что большое количество атомов Бе находится на поверхности частиц и
Принятые сокращения: НЧМ — наноразмерные частицы магнетита, МНФ — мононуклеарные фагоциты.
* Адресат для корреспонденции.
взаимодействует с окружающей средой, принимая или отдавая электроны, что способствует формированию ионов и радикалов [4].
Интересным является тот факт, что НЧМ после их введения в организм накапливаются в органах, которые обладают развитой системой мононуклеарных фагоцитов [5]. Доказано, что НЧМ оказывают токсическое влияние на печень, легкие и почки экспериментальных животных [6]. Так, после перорального введения НЧМ наблюдаются морфологические признаки повреждения гепатоцитов, сопровождаемые повышением активности аланинаминотрансфера-зы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы в плазме крови крыс [7].
НЧМ могут использоваться в качестве основы для создания магнитоуправляемых систем целевой доставки терапевтических и диагностических средств, как самостоятельные терапевтические агенты, а также как контрастные вещест-
ва при томографических исследованиях [3, 8, 9]. Уникальные электрические, спектральные и термические свойства НЧМ создают новые возможности для обнаружения и лечения заболеваний, которые на сегодняшний день трудно поддаются коррекции.
Биомедицинское применение наноматериа-лов в ряде случаев ограничивается их высокой цитотоксичностью [9]. Для снижения или устранения повреждающего действия суперпарамагнитные НЧМ нуждаются в предварительной модификации, которая может достигаться путем покрытия их поверхности полисахаридами или липидами. Модифицированные НЧМ, обладающие большей биосовместимостью по сравнению с немодифицированными, имеют менее выраженный повреждающий эффект, большую скорость выведения из организма и прочие более выгодные фармакокинетические характеристики.
Все негативные эффекты, вызываемые применением НЧМ, можно разделить на прямые (непосредственные) и непрямые (опосредованные).
Прямые эффекты обусловлены действием НЧМ на клетку: накоплением их в цитоплазме, сорбцией на мембранах, механическим разрушением плазмолеммы и цитоплазматических мембран, изменением конформации биополимеров с нарушением их функции и т.д.
Непрямое действие НЧМ всегда опосредуется различными факторами (перекисной модификацией молекул с изменением свойств последних, изменением параметров гомеостаза, активацией эндогенных факторов повреждения, свертывающей и калликреин-кининовой систем и др.), возникающими в ответ на введение наноматериала в организм. Среди прочих факторов, опосредующих повреждения клеток, следует назвать ишемию, вызванную эмболией сосудов микроциркуляторного русла агломератами НЧМ. Участие НЧМ в активации иммунной системы может обеспечиваться адъювантным или гаптенным механизмами, а также опосредоваться цитокинами, выделяемыми активированными фагоцитами [2, 3, 10].
Таким образом, цитотоксичность НЧМ объясняется присутствием в их составе металла с переходной валентностью. Несомненный интерес представляет изучение возможности и путей вовлечения атомов металла, входящих в состав НЧМ, в обмен железа организма крыс.
Цель исследования: выявление изменений основных показателей, характеризующих обмен железа в организме, после однократного внутривенного введения магнитных микросфер и маг-нитолипосом на основе НЧМ в эксперименте.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика НЧМ. НЧМ (FeO ■ Fe2O3) получены механохимическим способом в Отделе структурной макрокинетики ТНЦ СО РАН (Томск) [11]. Синтезированные НЧМ представлены агломератами размером 200—300 нм, состоящими из слабосвязанных друг с другом сферических частиц, средний диаметр которых составляет 7 нм. Среди различных ферритов (кобальтовый, марганцевый, литиевый, магниевый и др.) НЧМ имеют наиболее выраженные магнитные свойства. Основными магнитными характеристиками НЧМ являются удельная намагниченность насыщения (26 Гс ■ м3/г) и эффективная напряженность поля анизотропии (520 Э) [12]. Площадь удельной поверхности НЧМ - 150 м2/г.
1. Приготовление стабилизированной суспензии немодифицированных НЧМ. Навеску НЧМ добавляли в водно-солевой стабилизирующий раствор (рН 7,4), содержащий 108 мМ хлорид натрия, 20 мМ цитрат натрия («Реахим», Россия) и 10 мМ динатриевую соль Hepes («AppliChem GmbH», Германия). Полученную суспензию подвергали сонификации (20 мкА, 22 кГц) на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т («Укрросприбор», Украина) в течение 30 мин для разрушения агломератов НЧМ. После дезинтеграции суспензию центрифугировали (500 g, Кротора = 10 см) в течение 10 мин с целью осаждения сохранившихся агломератов. Супер-натант отбирали и фильтровали через поликарбонатные фильтры («Sartorius», Германия) с диаметром пор 100 нм под избыточным давлением аргона, после чего использовали для исследования.
2. Приготовление эмульсии липосом и суспензии магнитолипосом на основе НЧМ методом экструзии. Для получения мультиламелляр-ных везикул использовали: 1,2-дипальмитоил-глицеро-3-фосфохолин — DPPC — 103,98 мг, 1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфохолин - DSPC -12,44 мг («Lipoid GmbH», Германия); 1,2-дисте-ароил-глицеро-3-фосфоэтаноламин — DSPE — 0,88 мг, холестерол — Chol — 1,22 мг и а-токофе-рола ацетат — а-TA — 1,48 мг («Avanti Polar Lipids, Inc.», США). Липиды растворяли в хлороформе, после чего из полученной смеси на роторном испарителе ИР-1М2 («Химлаборпри-бор», СССР) в течение 40 мин при 56° получали липидную пленку, которую вновь ресуспенди-ровали в хлороформе и отгоняли на роторном испарителе. Процедуру повторяли трижды. Суммарная навеска липидов составила 120 мг. Молярные соотношения компонентов: DPPC : DSPC : : Chol : DSPE : а-TA = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 : 0,2 [13].
При получении полых липосом липидную пленку гидратировали в 15 мл стабилизирующего раствора (см. п. 1). Для изготовления магни-толипосом к липидной пленке добавляли 15 мл стабилизированной суспензии немодифициро-ванных НЧМ (см. п. 1). Образовавшиеся эмульсию и суспензию экструдировали через поликарбонатные фильтры («Sartorius», Германия) с размером пор 200 нм при 40° под избыточным давлением (15 атм.) аргона на экструдере Avanti Mini-Extruder («Avanti Polar Lipids, Inc.», США). Содержание липидов в полученной эмульсии — 8 мг/мл.
3. Приготовление суспензии модифицированных хитозаном НЧМ. Навеску хитозана (100 мг) растворяли в 100 мл 0,06%-ного водного раствора лимонной кислоты. Раствор хитозана и стабилизированную суспензию немодифицирован-ных НЧМ (в соотношении 1 : 1) перемешивали на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Доводили рН полученной суспензии до 7,2 0,1 М водным раствором гид-роксида натрия («Реахим», Россия), после чего подвергали сонификации на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (20 мкА, 22 кГц) в течение 10 мин. Суспензию фильтровали через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 100 нм под избыточным давлением аргона, после чего использовали для исследования.
Определение концентрации железа в суспензии проводили рентгенофлуоресцентным методом (спектрометр Quant'X, «ThermoScientific», Великобритания). Z-Потенциал частиц и их распределение по размерам устанавливали методом динамического светорассеяния на лазерном анализаторе Zetasizer Nano ZS («Malvern Instruments», Великобритания). Форму и структуру частиц в суспензии определяли с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100 CXII («JEOL», Япония).
Дизайн эксперимента. Исследование проведено на 320 беспородных половозрелых крысах-самцах линии CD, массой 200 ± 30 г, из которых было сформировано шесть групп: 1-я группа (40 крыс) — интактные животные — In; 2-я группа (40 крыс) — однократное внутривенное введение эмульсии полых липосом (160 мг (липидов)/ /кгмассы тела
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.