БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 2, с. 144 - 153
УДК 578.23
МЕТАНОЛ, ГЕНЕРИРУЕМЫЙ ПЕКТИНМЕТИЛЭСТЕРАЗОЙ, МОЖЕТ УЧАСТВОВАТЬ В РОСТЕ И РАЗВИТИИ ЛИСТЬЕВ
ТАБАКА***
© 2014 Т.В. Комарова12, Д.В. Поздышев12, И.В. Петруня2, Е.В. Шешукова2, Ю.Л. Дорохов12*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: dorokhov@genebee.msu.ru
2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991 Москва, ул. Губкина, 3; факс: (499)132-8962, электронная почта: dorokhov@genebee.msu.ru
Поступила в редакцию 26.09.13 После доработки 14.10.13
В процессе роста и развития листья претерпевают переход из состояния акцепторов (sink-листья) фотоасси-милятов к состоянию доноров (source-листья), сопровождаемый изменением активности межклеточного транспорта макромолекул. Подобная sink-source модификация происходит при участии фермента пектин-метилэстеразы (ПМЭ), деметилирующего пектин клеточной стенки и образующего метанол. При изучении роли метанола в функционировании плазмодесм мы обнаружили в sink-листьях табака повышенный уровень мРНК ПМЭ и увеличенную концентрацию метанола в соке. С помощью метода супрессионной вычитающей гибридизации мы идентифицировали ряд генов, активность которых изменяется при переходе от sink- к source-листьям. Среди них оказались гены, чувствительные к метанолу. На основании полученных результатов мы предположили возможность участия метанола в росте и развитии листьев растений.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пектинметилэстераза, метанол, плазмодесма, Nicotiana tabacum, транспорт.
Рост растения и переход верхушечного незрелого листа растения к состоянию зрелости сопровождается не только увеличением размеров клеток, но и двумя важными связанными между собой процессами. Во-первых, это изменение углеводного метаболизма, когда незрелые листья, потребляющие фотосинтетический углерод ^тк-листья) превращаются в зрелые листья, его производящие (8оигсе-листья) [1]. Второй процесс — это модификация межклеточного транспорта макромолекул, осуществляемого с помощью плазмодесм [2]. Если в 8тк-листьях плазмодесмы простые и характеризуются высокой пропускной способностью, обеспечивающей свободный транспорт макромолекул между клетками, то при переходе к 8оигсе-листьям плазмодесмы становятся ветвистыми, с ограниченной пропускной способностью [2—5].
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-279, 05.01.2014.
*** Адресат для корреспонденции.
Этот переход контролируется рядом генов. Так, у Arabidopsis thaliana sink-source трансформация сопровождается изменением экспрессии генов, increasedsize exclusion limit 1 (ISE1), 2 (ISE2) [6—8] и decreased size exclusion limit 1 (DSE1) [9], которые повышают или снижают проницаемость плазмодесм соответственно. Одновременно в ходе sink-source преобразования увеличиваются размеры клетки и модифицируется клеточная стенка, которую пронизывают плазмодесмы. ПМЭ принимает непосредственное участие в этих процессах, катализируя деметилирование пектина с образованием метанола [10—12]. До недавнего времени метанол рассматривали в качестве побочного продукта или биохимического мусора [13]. Механическое повреждение листа сопровождается выбросом в атмосферу газообразного метанола, вызывающего в соседних растениях индукцию транскрипционной активности генов, вовлеченных в межклеточный транспорт и антибактериальную устойчивость [14]. С другой стороны, имеются экспериментальные данные о потенциальной роли метанола в процессах роста и развития растений [15]. Мы ис-
следовали вопрос, может ли метанол играть роль сигнальной молекулы, участвующей в росте и развитии листьев растений. Для этой цели были использованы листья табака (Nicotiana tabacum), для которого, в отличие, например, от Nicotiana benthamiana, подробно описаны физиологические и анатомические особенности sink- и source-листьев [2—5]. В настоящей работе были идентифицированы новые метанол-индуцируемые гены, которые возможно вовлечены в регуляцию sink-source трансформации листьев.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Условия выращивания растений. Растения Nicotiana tabacum сорт Samsun (nn) выращивали в теплице в горшках со смесью листовой земли, перегноя, торфа и песка при контролируемом световом цикле день/ночь 16/8 ч и температуре 25/18°. В экспериментах использовали растения, имеющие возраст 11—12 недель и 5—6 истинных листьев.
Анализ содержания метанола. Для определения концентрации метанола в соке растения отбирали 30 мг растительной ткани, гомогенези-ровали и центрифугировали при 16 000 g 10 мин. К супернатанту добавляли равный объем 20%-ной трихлоруксусной кислоты и после 20-минутной инкубации во льду центрифугировали при 16 000 g 15 мин. Затем измеряли содержание метанола в супернатанте как описано ранее [14].
Агроинъекция. В клетки Agrobacterium tumefa-ciens (штамм GV3101) была введена плазмида, кодирующая двукратный GFP (2xGFP) под контролем 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (cauliflower mosaic virus, CaMV). Культуру агробактерии выращивали 18—20 ч при 28° в LB-среде, содержащей 50 мг/л рифампи-цина, 25 мг/л гентамицина и 50 мг/л канамици-на. Клетки из ночной культуры (5 мл) собирали центрифугированием (10 мин, 4500 g), ресус-пендировали в буфере, содержащем 10 мМ MES, рН 5,5, и 10 мМ MgSO4, и доводили до конечной плотности суспензии, соответствующей OD600 0,01. Для анализа межклеточного транспорта в листья N. tabacum вводили полученную суспензию агробактерии, несущей бинарный вектор CaMV 35S промотор-2хGFP.
Детекция GFP. Подсчет флуоресцирующих (содержащих 2хGFP) клеток проводили через 24 ч после агроинфильтрации с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М с использованием следующих фильтров: BP470/40 (возбуждение) и BP525/50 (испускание) («Zeiss», Германия).
Выделение РНК. Тотальную РНК из листового материала выделяли с помощью TRI Reagent
(«MRC», США) согласно протоколу производителя.
Супрессионная вычитающая гибридизация (СВГ). Тотальную РНК выделяли из sink-листь-ев размером 3 см и source-листьев размером 10—13 см и использовали для получения библиотеки кДНК методом СВГ [16]. Сама процедура СВГ была проведена ЗАО «Евроген», причем вычитание осуществляли в обоих направлениях — библиотека кДНК sink-листа вычиталась из библиотеки кДНК source-листа и наоборот (http://evrogen.ru/services/cDNA-subtraction/ser-vice-cdna-subtraction.shtml).
Обратная транскрипция и метод количественной ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ). Для получения кДНК использовали 2 мкг тотальной РНК, 2 пмоль праймера «oligo-dT18» и 0,1 мкг смеси случайных гексамеров, реакцию обратной транскрипции проводили согласно протоколу производителя Superscript II reverse-transcriptase («Invitrogen», США). ПЦР в реальном времени осуществляли на приборе iCycler iQ real-time qPCR detection system («Bio-Rad», США). Для кДНК GFP была использована 2,5-кратная реакционная смесь Eva Gren («Синтол», Россия) согласно прилагаемой инструкции. Каждую пробу промеряли трижды, концентрации мРНК для оценки изменений были предварительно нормированы на 18S рРНК. Были использованы следующие праймеры: «BG-F1» GATTGTTGT-GTCCGAGAGTG; «BG-R1» CCAGTTCAGGG-TTCTTGTTG; «NCAPP-F1» CTATGTCTTCAA-AGATTAGTCTG; «NCAPP-R1» GGACGGAAA-TGATTGTGGC; «PME-F1» ATCCTTGGATTC-CGGCAAGAACGT; «PME-R1» AAACACTTGC-AATTGTAGAGTAAC; «PI-II-F1» ATGTACCTC-GCCAAACTTAC; «PI-II-R1» CTCCATCTATTT-ATAGCAAACG; «MIG-21-F1» AGGAAGGCAG-TTTCATGCATAA; «MIG-21-R1» GCCTCTTAT-TTGTTTGAGTTATGCCTC; «ISE2-F1» ACAGT-GGCAAAAGGAAGG; «ISE2-R1» TAAGAGGA-GTAGTATAGAATAGTC; «ERP-F1» TGATGGT-GGCTATGGTAGTG; «ERP-R1» CTGGCTCTG-GCTGTAGTG; «SEO-F1» CTGGAAGCATTGG-AAGAGAAGG; «SEO-R1» GGTTGTGAGCGA-GTGAAGC; «SABC-F1» TGTCCCTGGTCTTTA-CTATTCG; «SABC-R1» GCGGTGATTATTGT-GATGAGC; «ARP-F1» GGATGATGTTATGGC-TGGAC; «ARP-R1» GTGACGGAGTTGTTGG-TG; «ST-F1» TCAAGACCAACACTACACTCC; «ST-R1» CCACCCACCACTGATAATAGG.
Обработка растений метанолом. Растения подвергали воздействию паров метанола в герметичном 20-л эксикаторе. Горшки (ширина 9,5 см, глубина 9,5 см), содержащие растения (весом 10,0 ± 1,0 г) и почву (весом 198,0 ± 20,0 г), помещали в эксикатор с метанолом (160 мг), нане-
сенным на фильтровальную бумагу, как описано ранее [14]. Растения выдерживали 3 ч при постоянной температуре 24°, конечная концентрация газообразного метанола составляла 17,5 мкг на 1 г сырого веса листа. Затем из source-листь-ев выделяли РНК, получали тотальную кДНК и анализировали методом количественного ПЦР в реальном времени.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Измерение уровня мРНК ПМЭ и концентрации метанола в sink- и source-листьях табака.
Изучение роли ПМЭ в развитии листьев проводили на молодых растениях табака, N. tabacum с 5—6 настоящими листьями (рис. 1, а). В качестве sink-листьев брали небольшие листья размером около 3 см (рис. 1, а, верхняя вставка). В качестве source-листьев были выбраны листья размером 10—13 см (рис. 1, а, нижняя вставка), расположенные в нижних ярусах табака. Важной характеристикой sink-листьев является более высокая пропускная способность плазмодесм, позволяющая осуществлять межклеточный транспорт молекул белка размером более 47 кДа [3]. Для оценки состояния плазмодесм sink- и source-листьев мы использовали репортерную молекулу, содержащую две копии белка GFP ^GFP), слитых между собой. Генетическая конструкция, содержащая ген 2xGFP под контролем CaMV 35S промотора, описанная ранее [14], доставлялась в клетки N. tabacum с помощью инъекции листьев разбавленной (до OD600 ~0,01) суспензией соответствующей агро-бактерии. Через 24 ч проводили подсчет флуоресцирующих клеток эпидермиса, дающий количественную оценку распространения 2хGFP. В случае пониженной пропускной способности плазмодесм, характерной для зрелых source-листьев, 2хGFP обнаруживался, в основном, в одиночных клетках (рис. 1, б, верхняя фотогра-
фия). При «открытии» плазмодесм флуоресцентный сигнал распределен в кластерах, состоящих из 2—4 клеток (рис. 1, б, нижняя фотография). Рис. 1, в показывает, что в source-лист
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.