научная статья по теме МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ ПРИ ПОМОЩИ ГОМОЛОГИЧНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Химия

Текст научной статьи на тему «МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ ПРИ ПОМОЩИ ГОМОЛОГИЧНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 3, с. 429-432

УДК 577.112; 577.336

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ ПРИ ПОМОЩИ ГОМОЛОГИЧНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

© 2011 г. А. А. Пахомов#, В. И. Мартынов

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступило в редакцию 19.11.2010 г. Принято к печати 29.11.2010 г.

В работе представлен метод установления пространственной структуры ОБР-подобных флуоресцентных белков. Метод основан на объединении результатов гомологичного моделирования общей пространственной структуры белка и структуры хромофора, установленной экспериментально при помощи масс-спектрометрии. Предложенный подход может быть использован для определения пространственной структуры трудно кристаллизующихся гомологов ОБР.

Ключевые слова: хромофор, хромопептид, флуоресценция, гомологичное моделирование.

ВВЕДЕНИЕ

Основным методом определения пространственной структуры белков является метод кристаллографии [1—6]. Кроме того, для предсказания структуры белков часто применяется метод гомологичного моделирования [7, 8]. Для GFP-подобных белков последний подход не применим в исходном варианте, так как при помощи моделирования невозможно предсказать структуру хромофора — ключевого компонента флуоресцентного белка [9—12]. В настоящем исследовании разработан метод для установления структуры флуоресцентных белков, объединяющий гомологичное моделирование in silico для определения общей пространственной структуры белка и эксперименты in vitro для установления структуры хромофора. Экспериментальное установление структуры хромофора включает в себя выделение из белка небольшого хромофорсо-держащего пептида и последующий его масс-спек-трометрический анализ. Последний подход использовался нами ранее для установления структуры хромофора в ряде GFP-подобных белков и описан в работах [13—18]. Включение структуры хромофора в рассчитанную модель белка позволяет получить полную пространственную структуру исследуемого белка.

Сокращения: GFP, avGFP — зеленый флуоресцентный белок из Aequorea victoria; Kaede — флуоресцентный белок из Trachyphyllia geoffroyi; EosFP — флуоресцентный белок из Lobophyllia hemprichii; DsRed — красный флуоресцентный белок из Discosoma sp. # Автор для связи (тел.: (495) 336-51-11; факс: (495) 336-61-66; эл. почта: alpah@mail.ru).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В отличие от обычных белков, GFP-подобные флуоресцентные белки содержат хромофор, синтезирующийся автокаталитически в результате циклизации основной цепи полипептида. Эта особенность осложняет гомологичное моделирование флуоресцентных белков и требует привлечения дополнительных методологий для учета присутствующего в структуре хромофора. В данной работе моделирование осуществляли при помощи программы MODELLER [19], которая строит модель на основе пространственных ограничений, рассчитанных с учетом выравнивания последовательностей анализируемого белка и структуры-шаблона. Также она может осуществлять de novo предсказание петель и выполнять оптимизацию модели путем минимизации потенциальной энергии, используя методы сопряженного градиента и имитации отжига с молекулярной динамикой структуры [20].

При выравнивании последовательностей моделируемого белка и шаблона возможно несколько вариантов. Во-первых, можно оставить хромофор-образующую последовательность -Хаа-Tyr-Gly-анализируемого белка немодифицированной. В этом случае в смоделированной структуре конфор-мации аминокислот в ближайшем окружении хромофора будут, очевидно, отличаться от таковых в нативном белке, так как геометрия -Xaa-Tyr-Gly-трипептида существенно модифицируется при превращении в хромофор. Тем не менее данный подход может быть использован для генерации промежуточных состояний белка, которые трудно выявить при помощи кристаллографических исследований. Во втором варианте вместо хромофор-образующей триады можно использовать -Gly-

I— KikG

'— Dronpa I— Kaede EosFP

E

DendFP cFP484 Azami-Green

EzoanYFP zoanGFP zoan2RFP

- Kusabira-Orange

— amFP486

hzEK

Rtms5 Keima DsRed dsFP483

- HcRed

- asFP595

- cjBlue

- eqFP611 ■ eqFP578

asFP499

- cmFP512

i.'

200.7

ppluGFP2 -CpYGFP

s s

i-4 ft <D

X

m

-EP O D

<u S X

<D

ce X 00

GFP aceGFPL cgGFP anm2CP

200 150 100 50 0

Число замен на каждые 100 нуклеотидов

Рис. 1. Филогенетическое дерево GFP-подобных белков с известной кристаллической структурой.

Gly-Gly-последовательность. Поскольку глицин обладает высокой торсионной свободой, данная последовательность хорошо вписывается в полость хромофора. В этом случае на заключительной стадии моделирования -Gly-Gly-Gly-после-довательность необходимо заменить на хромофор. Наиболее же точным является метод моделирования с хромофором, включенным в последовательность белка в виде гетерогруппы на стадии выравнивания последовательностей. В этом случае MODELLER переносит хромофор в созданную модель без модификаций как жесткое тело. При данном подходе, однако, необходимо изменить структуру хромофора в структуре-шаблоне, если она отличается от таковой в анализируемом белке.

Возможность предсказания структуры флуоресцентных белков с помощью гомологичного моделирования связана с тем, что гомология между отдельными представителями составляет от 20 до 80%. Кроме того, в основных ветвях филогенетического дерева GFP-подобных белков можно найти один или несколько белков с известной кристаллической структурой (рис. 1). Для проверки применимости метода к флуорес-

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040 -

(а)

0.045

0

50 100 150

Аминокислотная позиция (б)

200

Рис. 2. Анализ полученной модели белка Kaede. (а) Профиль DOPE для шаблона EosFP (PDB ID: 1ZUX), рассчитанной модели Kaede и кристаллической структуры Kaede (PDB ID: 2GW3). (б) Наложение смоделированной и кристаллической структур белка Kaede в районе ближайшего окружения хромофора. Остаток хромофора отмечен темно-серым тоном.

центным белкам мы смоделировали структуру фотоконвертируемого белка Каеёе с известной структурой (РЭВ ГО: 2GW3) [21], используя в качестве шаблона белок Б08РР (РЭВ ГО: ^ЦХ) [22]. Гомология между белками составляет 83.6%, и оба белка имеют одинаковые хромофоры. Выравнивание последовательностей и построение модели осуществлялись при помощи программы MODELLER9v7 (см. "Эксперимент. часть"). Качество модели было проверено расчетом DOPE-энергий [23] остатков для каждого белка (рис. 2а).

Построенный профиль DOPE-энергии модели Каеёе демонстрирует значительную модификацию относительно исходного шаблона и становится

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 37 № 3 2011

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ

431

практически идентичным для профиля кристаллической структуры, что свидетельствует о высоком сходстве экспериментальной и смоделированной структуры. При визуальном сравнении модели и кристаллической структуры наблюдается практически идентичное расположение аминокислотных остатков внутри структуры ß-цилиндра, включая остатки окружения хромофора (рис. 2б). Для боковых цепей, расположенных с внешней стороны ß-цилиндра, в особенности для длинных цепей остатков Lys, Arg и Met, наблюдались значительные отклонения от кристаллической структуры. Однако нужно отметить, что даже в рештеноструктурных исследованиях длинные боковые цепи наружных аминокислот часто либо плохо разрешены, либо разрешены не полностью из-за их высокой подвижности и присутствия в структуре сразу нескольких ротамеров [24]. В целом, рассчитанное среднеквадратичное отклонение (rmsd) для а-углеродных атомов составило 0.24 Â, а для для всех атомов внутри ß-цилиндра — 0.55 Â. Такие расхождения можно считать допустимыми, так как даже при кристаллизации одного и того же белка в разных условиях отклонения могут быть более существенными.

Таким образом, в настоящей работе продемонстрирована возможность применения гомологичного моделирования к флуоресцентным белкам в случае, если структура хромофора установлена предварительно при помощи экспериментов in vitro. На примере белка Kaede с использованием EosFP в качестве шаблона показано, что метод дает довольно высокое совпадение модели с установленной ранее кристаллической структурой. Таким образом, гомологичное моделирование совместно с масс-спектрометрией позволяет получить полную структуру флуоресцентных белков и может использоваться для определения пространственной структуры, когда кристаллизация гомологов GFP затруднена или невозможна.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Множественное выравнивание последовательностей GFP-подобных белков с известной кристаллической структурой проводили при помощи ClustalW-метода [25]; филогенетическое дерево было построено при помощи программы MegAlign из пакета DNASTAR (http://www.dnas-tar.com). Парное выравнивание последовательностей и последующее гомологичное моделирование было осуществлено при помощи программы MODELLER9v7. При моделировании хромофор был введен как жесткое тело в режиме, учитывающем гетероатомные остатки. Оценка модели проводилась с использованием объективной функции программы MODELLER и DOPE-про-филя структуры в соответствии с инструкцией (http://salilab.org/modeller/). На заключительной стадии качество модели проверяли при помощи

программы COOT [26]. Рисунки структуры были получены с использованием программы PyMOL [27] (http://www.pymol.org).

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при финансовой поддержке программы "Молекулярная и клеточная биология" РАН, Российского фонда фундаментальных исследований (№ 10-04-00471), гранта Министерства образования и науки в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы" (П1240), а также гранта Президента Российской Федерации (MK 1094.2009.4).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Shu X., Shaner N.C., Yarbrough C.A., Tsien R.Y., Remington S.J. // Biochemistry. 2006. V 45. P. 9639-9647.

2. Suto K., Masuda H., Takenaka Y., Tsuji F.I., Mizuno H. // Genes Cells. 2009. V. 14. P. 727-737.

3. Kikuchi A., Fukumura E., Karasawa S., Mizuno H., Miyawaki A., Shiro Y. // Biochemistry. 2008. V

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком